报告基因

报告基因(ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控,筛选得到转化体。作为报告基因,在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件:(1)已被克隆和全序列已测定;(2)表达产物在受体细胞中不存在,即无背景,在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域,已使用的…     

人干细胞因子基因5′旁侧序列的克隆和功能研究

人干细胞因子 ( human stem cell factor,h SCF)在多种哺乳动物干细胞的增殖、分化和移居中发挥重要作用 .利用改进的 PCR体系 ,从人类基因组 DNA中扩增出自 h SCF基因编码起始位点( 1 81 )至 5′旁侧 - 1 1 90位点共 1 372 bp的片段 ,将其克隆至 p GEM- T载体中 ,经序列分析证明无误 .为探寻此片段中对转录调控起作用的具体区域 ,用基因缺失技术从 - 1 62 ( Bst X )位点向上游分别延伸至 - 2 73( Pst )、- 339( Sma )、- 381 ( Sac )、- 44 0 ( Eco R )、- 570 ( H inc )、-853( Bgl )及 - 1 1 90 ( Xho )等位点 ,共获 7个不同长度的 h SCF基因 5′旁侧序列片段 ,随后将这7个片段分别克隆入荧光素酶 ( luc)报告基因载体 p GL2 - Promoter.经阳离子脂质体包埋技术介导转染 He La细胞 ,培养 48h后检测 Luc活性 .结果表明 :h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域对luc表达有明显的增强作用 ,而 - 339～ - 2 73区域则显示有抑制作用 .分别以包含这两个区域的片段为探针进行竞争性凝胶阻滞实验 ,结果均出现一个或多个特异性滞留区带 ,说明这两个区域存在转录因子的结合位点 .实验结果表明 ,h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域富含 AT,是一典型基质结合区 ,而 - 339～ - 2 73区域为一新的沉默子 ,在     

niaD基因与uidA基因共转化糖化酶高产菌株Aspergillus niger T21

从Aspergillu niger T21 分离到自发性的氯酸盐抗性株,再经氮源生长试验获得硝酸盐还原酶缺陷的niaD 突变体N44。用含有niaD的质粒pSTA10转化N44,转化频率为5个／μg(转化子/DNA)。转化子的Southem印迹分析表明niaD基因同源整合到N44的染色体DNA中。pSTA10与含葡糖苷酸酶基因(uidA)的质粒pNOM102共转化N44,共转化频率为40％。共转化子的(GUS(葡糖苷酸酶)活力测定结果表明uidA基因已在N44中表达。由此可知,以niaD为选择标记,uidA为报告基因,以N44为受体的转化系统可用于丝状真菌启动子功能检测和已知调控序列的功能分析。     

显性插入突变载体的设计

显性插入突变载体的设计陆建荣,金振华（中国科学院发育生物所,北京１０００８０）当可移动的ＤＮＡ片段（如转座子）插入到基因组其它基因座位,破坏了后者表达所需的完整性时,就产生了插入突变效应。由于插入的ＤＮＡ可以作为内置的标签（ｂｕｉｌｔ－ｉｎｔａｇ）,使得分离相应的基因极为简便。近年来插入突变在高等真核生物研究中得到广泛的应用,［１］除转座子外,一些转基因载体如动物的逆病毒载体,植物农杆菌的Ｔi或Ri质粒都能将外源DNA稳定整合到宿主基因组,也成为极有用的插人突变载体。     

细菌荧光酶报告基因载体构建及在Hela细胞中的表达*

采用ＰＣＲ点突变技术,构建含有细菌荧光酶融合ｌｕｘＡＢ报告基因的重组哺乳动物载体ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｘＡＢ,脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染和Ｇ４１８抗性筛选稳定转染的Ｈｅｌａ细胞。ＰＣＲ和酶切电泳证明构建的正确性;经稳定转染ｐｃＤＮＡ_３－ｌｕｘＡＢ的Ｈｅｌａ细胞,用发光仪可测得较强的发光强度（最大值为４．１２ｍＶ／４０μｇ细胞总蛋白粗提物）。而亲本及ｐｃＤＮＡ_３稳定转染的Ｈｅｌａ细胞则在本底值范围,ｐｃＤＮＡ_３<