4E-BP1、4E-BP1-4A 重组慢病毒载体的构建及对胃癌细胞 HGC27生长的影响

目的:构建4E-BP1及其 T37A、T46A、S65A、T70A 突变体4E-BP1-4A 基表达的重组慢病毒载体,研究其对胃癌 HGC27细胞生长的影响.方法:PCR 扩增4E-BP1基及其突变体4E-BP1-4A 基并克隆到 pCDH 载体,构建成 pCDH-4E-BP1、pCDH-4E-BP1-4A,将其与包装载体共转染293T 细胞,包装成 Lenti-4E-BP1及 Lenti-4E-BP1-4A重组慢病毒载体,将此慢病毒感染胃癌 HGC27细胞,Western 印迹鉴定病毒载体介导的4E-BP1、4E-BP1-4A 蛋白的表达,MTT、克隆形成和软琼脂方法研究过量表达4E-BP1、4E-BP1-4A 对胃癌 HGC27细胞生长的影响.结果:包装成 Lenti-4E-BP1及 Lenti-4E-BP1-4A 重组慢病毒载体,并将此慢病毒载体感染胃癌 HGC27细胞;MTT、克隆形成、软琼脂实验表明过量表达4E-BP1可抑制胃癌 HGC27细胞的生长,过量表达4E-BP1-4A 时抑制效果更明显.结论:构建了4E-BP1、4E-BP1-4A 的重组慢病毒表达载体,在胃癌 HGC27细胞中过量表达4E-BP1可抑制细胞生长,过量表达4E-BP1-4A 的抑制效果更明显.     

体外诊断试剂防腐剂的选择策略

对体外诊断试剂中防腐剂的作用机理及选择原则进行了阐述,并对目前常用的防腐剂如叠氮钠、庆大霉素、硫柳汞、异噻唑啉酮类等的性能进行了比较,为体外诊断试剂的研究开发及生产中防腐剂的使用提供有益指导。     

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)与动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)

阿尔茨海默病(AD)已成为威胁老年人生活的一种常见病,对老年人的生活质量有着严重的影响,目前尚无有效地防治方法。最新研究发现在阿尔茨海默病的病理发生中,神经细胞伴有显著的线粒体代谢紊乱和动态变化的异常,其中动力相关蛋白1(Drp1)是参与线粒体动态变化的关键分子。深入研究阿尔茨海默病中线粒体动态变化的异常及Drp1等关键分子的作用机制,对于揭示AD的发生机制及寻找药物作用靶点具有重要意义。综述了Drp1在阿尔茨海默病中的调控机制。     

FrzA基因转导干预缺血性心力衰竭小鼠心肌Wnt信号通路的研究

目的:研究重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)携带FrzA基因转导干预缺血性心衰小鼠心肌Wnt信号通路的可行性,为基因治疗心力衰竭提供新的思路.方法:选择3月龄雄性C57BL/6J小鼠共130只,随机分为空白组(n=10),心衰组(n=40),心衰+空病毒(rAAV9-GFP)注射组(n=40),心衰+rAAV9-FrzA组(n=40),采用结扎左冠状动脉定量控制心梗面积,于术后2周行心脏超声评各组心功能变化,再经尾静脉注射已稀释好的病毒,28d后处死小鼠取心脏标本,RT-PCR检测心肌目的基因FrzA以及Dvl-1,β-catenin的表达;Western blot检测心肌Wnt信号通路关键分子Dvl-1,GSK3β,p-GSK3β,β-catenin的表达.结果:与空白组相比,成功建立心衰模型后小鼠心功能均不同程度降低(P＜0.05);FrzA组与心衰组相比,心功能明显改善(P＜0.05);经尾静脉注射可成功将rAAV9-FrzA导入小鼠体内,并且目的基因FrzA在心肌组织中高表达(P＜0.05);心衰小鼠心肌中Wnt信号通路关键分子Dvl-1,p-GSK3β,β-catenin的表达显著升高(P＜0.05),FrzA转导后小鼠心肌中Wnt信号通路中关键分子Dvl-1,p-GSK3β,β-catenin表达均降低(P＜0.05)结论:利用rAAV9-FrzA转导缺血性心衰小鼠可以有效的干预心肌Wnt信号通路,抑制其活性,为基因治疗缺血性心衰提供了新的思路.     

人脑胶质瘤GDNF基因启动子I区H3组蛋白乙酰化修饰情况

目的：明确GDNF启动子I区在人脑胶质瘤中H,赖氨酸残基9位乙酰化（H3K9Ac）情况,探讨其对于GDNF在胶质瘤中表达的影响。方法：RT-PCR检测各组中GDNFmRNA的表达;建立基于Real．timePCR分析的染色质免疫共沉淀（CHIP）方法,检测12例胶质瘤与6例正常脑组织中GDNF基因启动子I区王H3组蛋白乙酰化情况。结果：Real-timePCR验证人脑胶质瘤GDNFmRNA的表达,转录水平随级另q的增高而增高,且低级别组、高级别组与正常组之间存在显著的统计学差异（P〈0．05）。启动子I区的H,组蛋白乙酰化水平,正常组与低级别组和高级别组之间比较均有显著性差异（P〈0．05）,且低级别与高级别之间也有显著性差异。结论：在人脑胶质瘤组织中,GDNF启动子I区发生了H3组蛋白高乙酰化修饰,这种修饰很可能会影响GDNF基因的表达。     

农杆菌介导的日本落叶松胚性细胞遗传转化研究

基于体细胞胚胎发生技术平台,利用携带pSuper1300+质粒,以潮霉素为筛选标记基因的农杆菌GV3101介导日本落叶松遗传转化,对植物受体材料生理状态、农杆菌浓度和浸染时间以及共培养时间等影响因素进行了研究、分析和讨论.结果表明:综合优化各影响因素,生长旺盛的日本落叶松胚性细胞,经浓度为0.4(OD600)的农杆菌浸染10min,共培养2d,再用含400mg/L的头孢霉素的液体培养基清洗脱菌,然后在含400mg/L的头孢霉素固体培养基上恢复培养,并置于含5mg/L潮霉素的固体培养基上多次筛选,最终共获得54个抗性细胞系,转化率平均为0.94个/g.PCR检测鉴定,所有抗性细胞系均为阳性转化体,并排除了农杆菌污染导致的假阳性.研究建立并优化了农杆菌介导的日本落叶松遗传转化技术,为进行遗传改良和基因功能鉴定提供有利平台.     

麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析

麦芽四糖淀粉酶是一种新型外切淀粉酶,从淀粉的非还原末端特异地顺序切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域.对来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的麦芽四糖淀粉酶基因序列进行优化,优化前后基因序列同源性达75％.将优化合成的成熟肽基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式存在.包涵体经变性、复性、多步纯化,获得有活性的麦芽四糖淀粉酶.将麦芽四糖淀粉酶与不同来源的淀粉水解反应,结果表明,该酶能与7种不同来源的淀粉反应产生单一的麦芽四糖.经SDS-PAGE电泳,DNS法和硅胶板薄层色谱分析法(TLC)进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶的分子量约为57kDa,纯化后的酶液最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0.研究结果为麦芽四糖淀粉酶的研究和开发提供依据和参考.     

慢病毒介导荧光素酶表达的人鼻咽癌细胞小鼠模型的建立

目的：建立荧光素酶标记的人鼻咽癌细胞裸鼠模型,活体成像系统监测肿瘤的生长并与肿瘤的体积进行对比。方法：构建表达荧光素酶基因2（1uc2）的慢病毒载体,与辅助质粒共转染293T细胞以制备慢病毒,感染人鼻咽癌SUNEl细胞后经嘌呤霉素筛选获得表达luc2的细胞株。活体成像设备体外检测不同数量细胞的发光强度,最后以5×10 6个细胞皮下接种BALB／cnu／nu裸鼠,活体成像系统动态记录接种后肿瘤的信号并与肿瘤的体积对比。结果：成功构建慢病毒表达质粒pLenti．1uc2并包装出慢病毒颗粒,病毒感染后嘌呤霉素筛选6天得到鼻咽癌细胞株SUNEl一luc2。细胞株传代后有稳定的发光强度,且经活体检测的每秒光子数与细胞数成正相关（R2=0．96）;活体成像观察发现裸鼠接种第2天接种部位的发光强度就达到3-2×10^8,而且成瘤过程中发光强度的变化与肿瘤大小一致。结论：成功构建适用于活体成像的人鼻咽癌SUNEl细胞的裸鼠成瘤模型,该模型从细胞接种开始即可有效动态监测鼻咽癌皮下瘤的生长及转移,从而为鼻咽癌的成瘤机制及药物干预研究提供一个新的手段。     

用SITSSICH风险评分预测脑梗死rt-PA静脉溶栓后症状性颅内出血风险的临床研究

目的：探索SITSSICH风险评分预测中国急性脑梗死患者rt．PA静脉溶栓（时间窗为4．5h,rt．PA剂量0．9mg／kg体重）治疗后症状性颅内出血（SICH）风险的效果,为使用SITSSICH风险评分指导溶栓治疗积累临床经验。方法：对86名进行rt-PA静脉溶栓（剂量0．9mg／kg体重）的急性脑梗死患者,进行SITSSICH风险评分,并记录总分及风险水平分层结果,按总分0、1、2、3、4、5、6、7、8、≥9分,分为10组,再按风险水平低危、平均、中危、高危分为4组,记录各组患者溶栓后有颅内出血（包括SICH）的比例,各组间进行比较。结果：SITSSICH风险评分0．5分、6分、7分、8分、≥9分各组SICH的比例分别为0．0％、8．3％、10．0％、25％和50．0％,卡方检验得x2=64．38,P〈0．001（线性趋势检验）,提示随着SITSSICH风险评分值的增加SICH的比例也在增加,存在统计学上的差异。SITSSICH风险评分风险水平低危及平均组的SICH比率为0％,中危、高危组的SICH比率分别11．5％,50％,卡方检验得xZ=-59．52,P〈0．001（线性趋势检验）,提示SITSSICH风险水平越高,SICH的比例也越高,存在统计学上的差异。另外,将SITSSICH风险评分风险水平分层和出血类型做spearman等级相关分析,得到spearman相关系数0．422,P〈0．001;说明SITSSICH风险评分风险水平分层和S1CH呈正相关。结论：对于经标准的rt—PA静脉溶栓方案（时间窗为4．5h,rt-PA剂量0．9mg／kg体重）治疗中国急性脑梗死患者,SITSSICH风险评分分值的增加与SICH风险的增加呈正相关,SITSSICH风险评分是一个能够预测rt-PA静脉溶栓后sICH风险的简单易行的实用的I临床工具。