一株甲基对硫磷降解菌-布朗克假丝酵母JMUPMD-1的分离与鉴定

对一株新分离的、能以甲基对硫磷为唯一磷源生长的菌株JMUPMD-1,利用形态特征观察和生理生化特性,及结合rDNA ITS分子序列分析对JMUPMD-1进行鉴定;采用气相色谱法检测培养过程中甲基对硫磷浓度的变化,确定甲基对硫磷降解速率。该菌株的rDNA ITS序列与布朗克假丝酵母（Candida blankii）的同源性为99％。形态特征和生理生化特性与布朗克假丝酵母相符合,因此鉴定为布朗克假丝酵母。以350μg／L甲基对硫磷为唯一磷源和350μg／L甲基对硫磷及1g／L K2HPO4组成的混合磷源培养该菌株,测得该菌株的降解率为48．6％。该菌株的胞内提取液具有明显的甲基对硫磷降解酶活性。     

伴有辅酶原位再生的胞外酶耦合法制备（R）-苯基乙二醇

经5轮诱变筛选,从近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis CICC1676）中分离得到产NADH依赖型羰基还原酶（Carbonyl reductase,CR）菌株CP-9。所产羰基还原酶（CRCp-9）经两步快速纯化获得纯化倍数为11．5倍,比活力为1．84 U/mg的酶液,其还原反应的最适pH值为6．5,最适温度为40℃。该酶转化β-羟基苯乙酮制备手性化合物（R）-苯基乙二醇,因此是（R）-专一性羰基还原酶。该酶与NADH普适性再生酶-甲酸脱氢酶（For-mate dehydrogenase,FDH）在胞外相耦联,构建伴有辅酶再生与反复利用的CR/FDH双酶催化制备立体醇体系,底物β-羟基苯乙酮转化率达95．4％,产物（R）-苯基乙二醇得率为93％,辅酶的总转化数（Total turn number, TTN）达267,产物e．e．值为98．6％,批次耦合反应生产能力达0．8 g/L/h,较单酶催化有较大提高,与细胞转化法相比也具有较好的生产能力。因此,伴有辅酶再生的胞外酶耦合催化具有潜在的制备手性醇化合物的工业应用价值。     

胶红酵母利用番茄渣和豆粕为原料发酵生产类胡萝卜素的研究

基于降低微生物类胡萝卜素生产成本的考虑,采用番茄渣、豆粕的纤维素酶酶解产物培养胶红酵母,以单位体积发酵液中的总类胡萝卜素浓度增量作为优化目标,先后运用逐步单因素法和均匀设计法系统性地考查了胶红酵母的总类胡萝卜素产量和增量与各个相关因素之间的关系。实验获得的总类胡萝卜素最大产量以及扣除了番茄渣中的类胡萝卜素含量而计算得到的增量分别为12.25 mg/L和10.25 mg/L。实验结果证明设计的生产工艺能够以较低的成本生产出富含类胡萝卜素的饲料,因而是经济可行的。     

中温淡盐法制备低核酸酵母抽提物的工艺研究

通过建立一种新的酵母核酸中温淡盐去除法,成功研制出品质优良的低核酸酵母抽提物。工艺简单,处理时间短,温度不超过70℃,可避免高温对酵母营养物质的破坏;该法氯化钠用量少,无需脱盐处理,易产业化及应用推广;研究制备的酵母抽提物,核酸去除量达70%以上,色浅、肉香味鲜,适合食品加工。同时,附加得到高提取率、高纯度的核酸。中温淡盐法去除酵母核酸的技术,扩展了酵母制品的应用领域,更为尿酸偏高及痛风人群食用安全营养的酵母食品提供了解决方案。     

黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析

根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计合成一段来自黑曲霉BK01的嗜热β-甘露聚糖酶基因,通过构建表达载体pPICZαA-man线性化后电转化入不同的毕赤酵母宿主,获得最佳重组菌KM71-MAN,其发酵罐发酵酶活最高达2 318.85 IU/mL。表达产物纯化后的分子量约为40 kD,最适反应温度为80℃,最适pH为5.0。该酶在70℃(pH5.0)保温44 h仍能保留43%的酶活力且在pH3.0-7.0范围内保温70 h(50℃)酶活力仍能保留85%以上。利用发酵罐所产重组酶酶解魔芋胶制备甘露低聚糖,产物以甘露二糖和甘露六糖为主,甘露低聚糖得率为55.6%。该重组β-甘露聚糖酶具有良好的热稳定性和pH稳定性,在魔芋制备甘露低聚糖中具有较好的应用潜能。     

人源CD137L基因在不同表达系统中表达效率的比较

比较分析人源CD137L在毕赤酵母、枯草杆菌及大肠杆菌中的表达差异,建立适合CD137L的表达系统并检测CD137L的生物学活性。设计PCR引物,以酵母表达质粒pPIC9K-CD137L为模板,扩增CD137L片段,分别构建枯草杆菌表达质粒及大肠杆菌表达质粒,再转化至相应的宿主菌并筛选阳性转化子;SDS PAGE电泳分析CD137L的表达情况并比较差异;稀释复性法复性CD137L包涵体,用离子交换层析纯化CD137L;T细胞激活试验检测CD137L的活性。CD137L在3个表达系统中均可以表达并且得到质谱鉴定,但是在毕赤酵母、枯草杆菌中的表达量微弱,而在大肠杆菌中CD137L以包涵体形式高效表达,平均1 L培养液能得到0.8 g包涵体沉淀,200 mg变性蛋白。经复性纯化后得到的CD137L能有效激活T细胞增殖并且其刺激活性呈现浓度依赖效应。与毕赤酵母、枯草杆菌相比,大肠杆菌表达系统能高效表达CD137L蛋白,并且经稀释复性后CD137L保持了刺激小鼠T细胞增殖的活性。     

芽殖酵母ASH1 mRNA的定位机制

mRNA定位是一种基因转录后水平的重要调控机制,对细胞的生理活动和分化发育都有着极其重要的作用。在芽殖酵母有丝分裂中,ASH1 mRNA在子细胞芽尖因不对称定位表达抑制了子细胞交配类型的转换。本综述介绍了芽殖酵母ASH1 mRNA定位的分子机制。     

代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素

β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母BY4742中过表达甲羟戊酸(MVA)途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)基因,来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的供给。在酿酒酵母底盘菌BY4742-T2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因,比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外,来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌,更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌BW02能生产1.56 mg/g细胞干重的β-胡萝卜素,为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。     

圆红冬孢酵母新颖脂肪酸合酶的重组表达、纯化与活性检测

脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FAS)催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A反应生成脂肪酸,是油脂合成代谢途径中最重要的酶之一。在高产油脂的圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides中发现了一种新颖的FAS,它含两个亚基,与其他物种的FAS相比,具有独特的结构域组成,尤其是含两个酰基载体蛋白(ACP)结构域。由于ACP在脂肪酸合成反应中起辅因子作用,推测多个ACP有利于提高FAS的催化活性,为研究该FAS的生物化学和结构特征,构建了表达FAS两个亚基的载体,并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),含pET22b-FAS1和pET24-FAS2质粒的重组菌株ZWE06可同时高表达两个亚基,经硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心和阴离子交换层析纯化,得到的重组FAS比活力达到548 mU/mg。纯化的FAS复合物可用于后续酶动力学和蛋白结构研究,且表达与纯化方法的建立对研究其他ACP的功能具有参考价值。     

过表达NADH激酶基因对酿酒酵母乙醇发酵的影响

甘油是酿酒酵母乙醇代谢途径中的主要副产物,降低甘油生成,可以提高乙醇的产率和原料的利用率。以工业酒精酵母单倍体S1(MATa)为研究对象,构建了一个4.5 kb左右的基因敲除突变盒gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR,利用醋酸锂转化法转入S1,得到重组菌S3(gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR),使得工业酒精酵母在敲除GPD2的同时整合过表达了NADH激酶基因POS5。结果表明,在150 g/L的葡萄糖摇瓶发酵实验中,重组菌S3在不影响菌株生理特性的条件下,乙醇得率(g ethanol/g glucose)比原始菌株S1提高了8%,甘油得率(g glycerol/g glucose)降低了33.64%。本研究证明过表达NADH激酶基因可降低乙醇发酵中副产物甘油的生成并提高乙醇得率。