中国古老月季‘月月粉’FT/TFL1基因的鉴定与表达分析

该研究以中国古老月季品种‘月月粉’(Rosa chinensis‘Old Blush’)为试材,根据拟南芥和草莓FT/TFL1基因家族成员的保守结构域设计引物,对‘月月粉’基因组DNA进行克隆和测序,结合数据库序列和双单倍体基因组信息进行序列比对,结果共获得了8条月季的FT/TFL1基因家族序列,且8条序列分别注释为2个FT基因(RcFT1和RcFT2)、1个BFT基因(RcBFT)、1个ATC基因(RcATC)、2个MFT基因(RcMFT1和RcMFT2)和2个PEBP基因(PEBP1和PEBP2);进化树分析结果将这8个基因分为3个亚组;结构分析显示8个基因的内含子为1～5个不等。qRT-PCR分析显示,RcFT1、RcPEBP、RcMFT1、RcMFT2和RcBFT在‘月月粉’的叶片中表达量最高,茎尖中次之;RcFT2在茎尖中的表达最高,叶片中次之;RcATC在茎尖中的表达量高于其他组织;除RcPEBP在根组织中有表达外,其他基因在根组织中几乎没有检测到。进一步表达分析显示,RcFT1和RcFT2在‘无刺光叶蔷薇’(R.wichuriana‘Basye’s Thornless')生殖生长期的叶片、茎尖中的表达量显著高于营养生长期。研究推测,具有连续开花性状的中国古老月季‘月月粉’可能具有多个开花时间(FT)基因位点,FT有可能可以作为月季生殖转换的标记基因。     

基于核酸自组装纳米结构的siRNA药物递送研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为转录后调节机制,可靶向mRNA进行剪切降解从而发挥基因沉默效应.siRNA (small interference RNA)因其高效性和特异性而被广泛应用于药物研究中.目前,研究者们已开发了多种阳离子载体用于siRNA递送.但由于siRNA双链结构具有相对较强的刚性结构,且阴离子电荷密度较低,无法与阳离子载体形成稳定、致密的复合物,使得siRNA的应用仍面临诸多挑战,如细胞摄取率低、靶向特异性差、递送过程不稳定、潜在的细胞毒性以及易诱发免疫反应等.近年来,核酸自组装纳米结构由于其结构灵活且负电荷密度较高而受到广泛关注,有望实现siRNA药物的高效递送和基因沉默.本文综述了近年来基于核酸自组装纳米结构的siRNA递送的研究进展及其应用.     

典型城市单元的土壤重金属溯源方法与实证研究

随着城市化进程的不断深入,土壤中重金属污染现状及其治理情况越来越受到重视,而查明污染源是有效治理污染的前提。源解析技术目前已广泛的应用于环境受体重金属来源解析实践中,总结了近年来土壤重金属成因分析的常用方法及原理,并提出了一种将多种方法相配合使用的方法体系。选取珠三角某市城郊农田作为研究对象,结果表明,Cd、Pb、Cu、Zn、As存在含量超过国家农用地筛选值的情况,其中Cd超标率高达60.1%。农业活动、工业生产、交通源和自然母质均对研究区土壤重金属的累积产生一定的贡献。正定矩阵因子分析法(PMF,Positive Matrix Factorization)模型模拟的Cd、Ni、Zn和Hg预测值与实测值线性拟合r~2均大于90%,其余元素r~2均大于60%,呈现出很好的相关性,满足研究需要。PMF模型和铅同位素比值法计算得到的交通及农业对土壤Pb累积的贡献率之和分别为86.0%和84.8%,PMF模型和物质流分析法计算得到的农业对土壤Cd的贡献率分别为86.7%和79.7%,结果均比较接近。结果表明正定矩阵因子法、同位素比值分析法,物质流分析法能很好的联用应用于土壤重金属源解析研究。     

毕赤酵母中tRNAPro CCG基因的表达及其作用效果

转运核糖核酸 (tRNA) 是蛋白质合成过程中重要参与成分之一,为了探索稀有密码子对应的tRNA (稀少tRNA) 丰度改变对外源基因表达量的影响,文中构建了毕赤酵母稀少tRNA基因与外源基因共表达体系。首先在GFP基因中添加由4个连续脯氨酸稀有密码子CCG组成的阻遏区,结果显示该GFP基因的表达量明显降低。然后将带有阻遏区的GFP基因和tRNAPro CCG基因顺次连接于pPIC9K载体上,在毕赤酵母GS115中共表达,结果使GFP表达量提高了4.9%;另将带有阻遏区的GFP基因和tRNAPro CCG基因分别连接于pPIC9K和pFLDα载体,在毕赤酵母GS115中共表达,GFP表达量最高提高了12.5%;应用同样方式将tRNAPro CCG基因与NFATc3T-GFP融合基因共表达,其表达量提高了21.3%。可见,tRNAPro CCG在毕赤酵母GS115中确为稀少tRNA,通过共表达tRNAPro CCG基因可显著提高带有连续该密码子的外源基因表达量,并且,文中构建的共表达体系将同样适用于其他稀少tRNA基因的筛选和验证。     

地衣芽胞杆菌FLP/FRT基因编辑系统的构建及验证

地衣芽胞杆菌有效的基因编辑工具有限,为了拓展和丰富其基因编辑手段,在地衣芽胞杆菌中构建一个抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并通过敲除α-淀粉酶基因amyL、蛋白酶基因aprE及敲入外源透明颤菌血红蛋白基因vgb对该系统进行初步验证。首先以温敏质粒pNZT1为载体分别构建amyL和aprE基因敲除质粒pNZTT-AFKF和pNZTT-EFKF,两个敲除质粒各自包含针对目标基因的同源臂、抗性基因及同向的FRT位点;将敲除质粒转化地衣芽胞杆菌并经过两次同源交换过程实现目标基因的敲除;最后导入一个FLP重组酶表达质粒通过FLP/FRT系统的重组作用介导抗性基因的回收。为进一步验证本系统的实用性及编辑效率,构建了包含透明颤菌血红蛋白编码基因vgb表达盒及基因组丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB敲除盒的重组质粒pNZTK-PFTF-vgb,并以此进行外源基因vgb在基因组上的定向敲入。结果显示,成功敲除amyL及aprE并回收了抗性标记卡那霉素基因,敲除后淀粉酶活和蛋白酶活分别减少95.3%和80.4%;vgb基因成功整合入基因组pflB位点并回收了抗性标记四环素基因,并利用荧光定量PCR技术检测到vgb的整合表达。文中首次建立了一个适用于地衣芽胞杆菌的、抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因编辑系统,并进行了基因敲除及基因敲入验证,为地衣芽胞杆菌遗传改造提供了良好的方法参考。     

基因敲除技术及其在研究线粒体动力学与胰岛素抵抗关系中的应用进展

线粒体动力学即线粒体融合和分裂保持动态平衡的过程,该过程由融合/分裂相关蛋白精确调控完成,对于线粒体代谢、质量和功能有着重要的生理意义,而这些蛋白发生异常可引发线粒体动力学失衡,进而引起线粒体功能障碍并引发各种疾病状态。文中围绕基因敲除技术,详细阐述了编码融合/分裂相关蛋白的基因敲除鼠在胰岛素抵抗研究工作中的作用及应用进展,以期为今后研究线粒体动力学失衡致胰岛素抵抗的信号转导机制奠定基础。     

重组人源性胶原蛋白的制备及表征

为了获得可实现工业化生产的重组人源性胶原蛋白,根据人I型胶原蛋白Gly-X-Y序列,优选亲水性的Gly-X-Y胶原肽段设计人源性胶原蛋白氨基酸序列及对应的核苷酸序列,利用酶切技术构建pPIC9K-COL表达载体,电转化毕赤酵母获得人源性胶原蛋白毕赤酵母工程菌,并对其进行发酵罐发酵、纯化及鉴定。结果显示,获得表达量达4.5 g/L,纯度大于95%的人源性胶原蛋白,经氨基酸N端测序、分子量测定、氨基酸分析及胶原酶降解试验,确定获得的蛋白与理论的人源性胶原蛋白一级结构一致;同时胶原经冷冻干燥后进行扫描电镜分析及细胞毒性试验,确定人源性胶原蛋白冻干品具有多孔纤维网状结构及优良的细胞相容性,预示其具备作为生物医学材料的潜质。     

北极狐β-防御素103基因 (CBD103) 启动子活性及转录调控元件分析

本研究旨在筛选调控北极狐毛色基因CBD103的启动子活性区域及转录因子结合位点,为揭示CBD103基因调控北极狐毛色形成的分子遗传机制提供依据。克隆获得了北极狐CBD103基因5′侧翼区2 123 bp的片段,并构建了4个不同长度的启动子缺失片段表达载体,通过双荧光素酶检测系统对启动子活性进行检测。对启动子活性最高区域预测出的3个特异性蛋白1 (Sp1)转录因子结合位点分别进行点突变并构建3个突变载体,利用双荧光素酶检测系统测定其活性。结果显示,在构建的4个不同长度启动子缺失片段中1 656 (-1 604/+51)区域活性最高,在此区域构建的3个突变载体的启动子活性较野生型(片段1 656)均显著降低,说明-1 604/+51区域为北极狐CBD103基因的核心启动子区,-1 552/-1 564、-1 439/-1 454和-329/-339区域为正调控区域。文中成功获得了北极狐CBD103基因的核心启动子区域和正调控区域,这为进一步研究该基因调控北极狐被毛颜色分子遗传机制奠定了基础。     

H1N1流感病毒对小鼠胚胎发育表型的影响

H1N1流感病毒属于常见的致病性病毒。流行病学调查研究表明,新生儿表型缺陷与流感病毒感染有关,但是具体机制还不明确。为了探讨H1N1流感病毒对胚胎发育的影响,本文通过流感病毒感染孕母鼠来构建流感病毒宫内感染的动物模型,分别在胚胎发育至E14.5、E15.5、E16.5、E17.5、E18.5 d以及出生1 d后测量各胚胎的体长,并在体视镜下观察胚胎体表各血管和器官来分析胚胎外表发育的情况,然后采用阿尔新蓝-茜素红染色法观察各发育时期胚胎骨骼发育的情况。结果表明,流感病毒感染的小鼠胚胎的体长明显降低。外部器官发育的差异性可体现在眼、耳等器官,攻毒组成型稍晚,尾部异常卷曲更为严重。各骨骼发育攻毒组较对照组更迟缓,但没有出现长短肢或骨骼缺失等严重异常表型。本研究首次构建了流感病毒宫内感染的动物模型,探究了H1N1流感病毒对小鼠胚胎表型发育的影响。     

基于CRISPR/Cas9技术的基因敲入/敲除策略

成簇的规律间隔性短回文序列(CRISPR)基因编辑系统,因其设计简单操作方便和无种属限制,已成为一种广泛应用的基因组定点编辑工具,在复杂的基因组编辑,例如基因的人源化改造以及条件等位基因的构建中有所应用。在自然界中,CRISPR系统拥有多种类别。其中,CRISPR/Cas9系统是研究最深入、应用最成熟的一种。本文针对CRISPR/Cas9系统,分别从基因敲入/敲除片段的大小、同源臂长短、构型即递送方式等技术环节进行综述,阐述不同设计及操作条件下由CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入/敲除的效率差异。