基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立

【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合, 建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方法】样品DNA制备前经EMA渗透预处理, 再进行实时荧光定量PCR特异扩增菌体DNA。【结果】终浓度为2.0 mg/L的EMA能有效排除1.0×107 CFU/mL灭活青枯菌细胞DNA的扩增, 对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)活菌的DNA扩增均没有影响。当每个定量PCR反应体系中的活细胞在5.0×100?5.0×104 CFU范围内时, 扩增Ct值与定量PCR反应体系中活细胞CFU对数值呈良好的负相关性(R2=0.992 5)。比较EMA-qPCR法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现, 待检样品可在24 °C与4 °C冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的EMA-qPCR方法能有效检测青枯菌VBNC细胞和有效区分死活菌, 避免或减少青枯菌PCR检测的假阳性和假阴性。     

钝齿棒杆菌argR基因缺失株构建及其缺失对精氨酸生物合成途径相关基因转录水平的影响

[目的]钝齿棒杆菌AS 1.542中argR基因编码的蛋白ArgR在精氨酸生物合成途径中扮演负调控的角色,但其对相关基因在转录水平的影响还未见报道.因此,本课题组构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并在转录水平上比较野生株与缺失株精氨酸生物合成途径相关基因的变化.[方法]采用无痕敲除的方法构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并采用荧光定量PCR方法分析缺失株和野生株精氨酸生物合成途径相关基因在转录水平的变化.[结果]利用pK18mobsacB质粒中蔗糖致死基因sacB反向筛选标记及PCR方法成功筛选到钝齿棒杆菌argR基因缺失株;荧光定量PCR结果表明,argR基因缺失株精氨酸生物合成途径中相关基因在转录水平获得大量提高,平均约上调162.13倍.[结论]钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径的相关基因受负调控蛋白ArgR的显著调控,但其基因的敲除并没有引起精氨酸产量发生明显的变化.     

定量蛋白质组学分析链霉素耐药和敏感结核分枝杆菌临床分离株

[目的]发现结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)链霉素耐药相关的潜在菌体蛋白.[方法]以结核分枝杆菌临床分离链霉素敏感株01105和结核分枝杆菌H37Rv为对照,采用iTRAQ技术和生物信息学鉴定并相对定量结核分枝杆菌临床分离链霉素耐药株01108菌体蛋白,并通过WEGO功能注释聚类分析01108菌株差异表达蛋白的细胞组分、分子功能和生物进程.[结果]01108菌株分别与01105菌株和H37Rv菌株比较差异表达蛋白为194个和146个,01108菌株与01105菌株和H37Rv比较均差异表达蛋白121个(共同差异表达蛋白).差异表达蛋白理论相对分子量和等电点分布广泛,其生物进程主要参与中间代谢、呼吸作用和脂质代谢,分子功能主要为催化活性功能和结合功能.共同差异表达蛋白:7个核糖体蛋白(Rv2785c,Rv0056,Rv0641,Rv0652,Rv0701,Rv1630和Rv2442c)在01108菌株中表达下调;7个蛋白在01108菌株中显著差异表达(上调大于1.20倍或下调小于0.55倍),分别为巯基过氧化物酶(Rv1932)、酰基载体蛋白脱氢酶(Rv0824c)、30S核糖体蛋白S15 (Rv2785c)、丙酮酸脱氢酶E2部分(Rv2215)、双组份转录调控蛋白(Rv3133c)以及假定未知蛋白(Rv2466c和Rv2626c).[结论]iTRAQ发现了链霉素耐药结核分枝杆菌相对于链霉素敏感结核分枝杆菌和H37Rv共同差异表达蛋白,为进一步探讨结核分枝杆菌链霉素耐药机制奠定了基础.     

TaqMan-MGB探针检测文森巴尔通体博格霍夫亚种实时荧光定量PCR方法的建立及应用

【目的】应用TaqMan-MGB探针技术,建立具有种水平特异性、高敏感性的荧光定量PCR方法,用于快速检测文森巴尔通体博格霍夫亚种。【方法】在序列特异性扩增区标记(Sequence characterized amplifiedregion,SCAR)技术基础上,依据文森巴尔通体博格霍夫亚种一段特有的基因序列设计探针和引物,分别优化扩增反应的退火温度、探针和引物的反应浓度;分析此方法的特异性、敏感性及重复性;绘制标准曲线,评估PCR反应的扩增效率和稳定性。【结果】本研究设计的TaqMan-MGB探针具有种水平特异性;最低检出限为每个PCR反应11个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.12%-0.70%和0.14%-0.55%,在允许范围内;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率高(E=104.7%)。【结论】本研究建立的基于TaqMan-MGB探针技术的荧光定量PCR方法能够在种水平特异性、高灵敏度检出文森巴尔通体博格霍夫亚种,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

温度、投饵频次对白色霞水母无性繁殖与螅状体生长的影响

白色霞水母是我国近海主要大型灾害水母种类之一,其暴发性增殖严重破坏了海洋生态系统平衡.在室内控制条件下,研究了温度(7.5、11、14.5、18、21.5和25℃)和投饵频次(1次/2d、1次/8d和1次/16d)对白色霞水母无性繁殖与螅状体生长的影响.结果显示,白色霞水母足囊繁殖的适宜温度为18-25℃,足囊繁殖随温度和投饵频次的增加而增加.温度对白色霞水母横裂率和横裂次数的影响显著,温度越高,白色霞水母发生横裂生殖的时间越早,横裂生殖速度越快,重复横裂次数越多,释放的碟状体数量也越多.横裂率和横裂次数随投饵频次的增加而递增.白色霞水母螅状体在7.5-25℃范围的成活率均为100％,其生长速度随温度和投饵频次的增加而增加.温度和投饵频次对白色霞水母螅状体足囊繁殖、横裂率和螅状体生长具有明显的交互效应.螅状体的横裂次数和初生碟状幼体伞径随螅状体柄径增大而递增,呈线性相关.研究表明,温度、投饵频次即营养条件显著影响着白色霞水母的种群数量,说明海水水温上升、富营养化或渔业资源锐减导致的浮游动物量增加均可能诱发白色霞水母暴发性增殖.结论为进一步探索大型水母暴发的生态环境机理提供重要科学依据.     

棉花节水灌溉气象等级指标

干旱是我国棉区主要的气象灾害,构建棉花不同发育期节水灌溉气象等级指标对于优化农田灌溉、指导农业生产具有十分重要的现实意义。论文基于农田水分平衡原理,利用全国347个地面气象观测站1961~2008年逐日气象资料、89个农业气象观测站1993~2008年（其中26个站为1980~2008年）逐旬土壤湿度、灌溉量、逐年作物产量等资料,结合FAO-1979作物产量-水分关系函数,针对全国棉区播种-现蕾、现蕾-开花、开花-吐絮和全生育期的水分亏缺率、水分亏缺量与减产率之间的关系,构建棉花不同发育期和全生育期节水灌溉气象等级指标。除发育时段不同外,其他在研究站点的选择、选取的因素等方面完全一致。结果表明：棉花全生育期节水灌溉气象Ⅰ~Ⅲ级水分亏缺率(D)和水分亏缺量（辅助指标）指标分别为：15%≤D＜30%、30%≤D＜45%、≥45%和1~2水、2~4水、≥4水;播种-现蕾为20%≤D＜40%、40%≤D＜50%、≥50%和0.5水、1水、＞1水;现蕾-开花为20%≤D＜35%、35%≤D＜45%、≥45%和0.5水、1水、＞1水;开花-吐絮为20%≤D＜35%、35%≤D＜50%、≥50%和1水、1~2水、＞2水。     

模拟酸雨对蒙古栎幼苗生长和根系伤流量的影响

选择中国北方落叶阔叶林的主要组成树种蒙古栎(Quercus mongolica Fisch.ex Ledeb.)的1年生幼苗为研究对象,设置4个酸雨酸度(重度、中度、轻度和对照)和3个降雨量(自然雨量和增、减雨量30％),以期阐明酸雨对蒙古栎幼苗形态生长、生物量和根系伤流量的影响,探讨中国北方日趋严重的酸雨是否会影响蒙古栎幼苗的生长,为酸雨区森林恢复植物的选择提供依据.研究结果显示:1)在本实验的酸雨酸度下,酸雨降雨量的增加对蒙古栎幼苗各生理生态指标均有一定的促进作用;2)酸雨酸度对蒙古栎幼苗形态和生物量的影响不显著,但酸度增加降低了幼苗的根系伤流量;3)增雨的重度酸雨处理促进了蒙古栎幼苗形态生长和生物量累积;4)两因素对蒙古栎幼苗的影响没有交互作用.说明蒙古栎对酸雨具有一定的抗性,可考虑选择为酸雨区植被构建的物种.     

不同苗龄沙地柏抗旱生理特性比较研究

以相同来源的1、3、5年生沙地柏幼苗为材料,采用室内生长池人工控水模拟不同干旱胁迫条件,对10个抗旱相关生理指标进行考察,探讨沙地柏苗龄对其抗旱特性影响。结果表明:（1）沙地柏叶片的保水力、细胞膜透性、RuBP羧化酶活性在胁迫前不同苗龄间差异显著,而叶片相对水分亏缺、气孔导度等指标不同龄苗间差异不显著。（2）在干旱胁迫条件下,随土壤含水量的降低,不同苗龄沙地柏的叶片水分亏缺、气孔导度差异一直不显著,而其净光合速率、蒸腾速率、水分利用率、胞间CO₂浓度在6.78%土壤水分含量时出现显著差异;当土壤水分含量降低到4.52%时,不同苗龄的叶片光量子效率也出现显著差异。（3）各苗龄组随着干旱胁迫的加剧,5年生沙地柏净光合速率、RuBP羧化酶活性、光量子效率显著低于1年生沙地柏,而其胞间CO₂浓度显著高于1、3年生沙地柏,并且其气孔导度、蒸腾速率随土壤水分含量降低而下降的幅度最大,水分利用率增加幅度比1、3年生的更多。研究表明,不同苗龄沙地柏幼苗抗旱性指标对干旱胁迫的响应程度存在差异,抗旱指标对苗龄的稳定性不同;干旱胁迫条件下低苗龄沙地柏比高苗龄的生长势更强,更有生命活力,但高苗龄沙地柏对水分胁迫的适应能力强于低苗龄;另外,在进行抗旱鉴定时,试验苗木年龄最好一致,抗旱鉴定指标选取也需考虑其对材料年龄的敏感性及稳定性。     

干旱胁迫对欧洲鹅耳枥幼苗生理生化特征的影响

以一年生欧洲鹅耳枥幼苗为材料,通过盆栽控水试验,设置5个土壤含水量梯度,研究不同梯度干旱胁迫对其幼苗生理生化指标的影响,以明确欧洲鹅耳枥的耐旱特性。结果显示:（1）随着干旱胁迫的加剧,欧洲鹅耳枥幼苗受到损害程度逐渐加重,形态表现出明显的缺水特征,叶片相对含水量和叶绿素总量随着干旱胁迫程度的增加而下降,且胁迫强度越强、时间越久其变化幅度越大。（2）幼苗叶片SOD活性、POD活性、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均随着干旱程度的增加表现出先升高后降低的趋势。（3）随着干旱胁迫程度的增加和干旱时间持续,幼苗叶片MDA含量和相对电导率总体上呈增大趋势,并在干旱末期达到最大值。研究表明,欧洲鹅耳枥幼苗在短期和轻度（田间最大持水量的60%）、中度（田间最大持水量的45%）干旱胁迫下能通过调节自身保护酶活性和渗透调节物质含量来减轻干旱造成的危害;而在重度（田间最大持水量的30%）干旱胁迫下,幼苗自我调节能力受影响,极度（田间最大持水量的15%）干旱胁迫对其造成一定的损害。研究认为,欧洲鹅耳枥具有一定的抗干旱特性,可在园林中推广运用。     

低温胁迫对极度濒危植物中华水韭生理特性的影响

以人工繁殖的极度濒危级(CR)植物中华水韭(Isoetes sinensis Palmer)为试验材料,研究了0 ℃低温环境下胁迫0~20 d,沉水叶片中保护酶系统(POD、SOD、CAT)、渗透调节物质(可溶性糖和可溶性蛋白)、叶绿素以及丙二醛(MDA)和相对电导率的变化。结果显示:随着低温（0 ℃）胁迫时间的延长,中华水韭沉水叶片的相对电导率、可溶性糖含量、CAT活性先升高后下降,SOD活性呈逐渐上升的趋势,POD活性、可溶性蛋白含量、叶绿素含量下降,MDA含量一直低于CK,且在一定范围内波动。研究表明,中华水韭沉水叶片在0 ℃低温胁迫中受到一定程度的伤害,但能通过调节自身的膜透性、渗透调节物质含量和保护酶活性系统来减轻低温伤害,维持其正常生理代谢功能,从而表现出一定的抗寒潜力。