t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。     

一种优化翻译起始效率的方法

本文以人分裂细胞核抗原(PCNA)基因作为目的基因,把包括PCNA基因5′端非翻译区(5′NTR)的24bp和编码38个氨基酸114 bp的顺序插入pTZ19R,构建与LacZ’5′端的融合基因。用寡核苷酸定点突变法在PCNA 5′NTR形成SD顺序,再用PCR法在SD顺序左右两侧分别随机突变6个和7个碱基,使它们与结构基因5′端顺序自发地形成各种可能的翻译起始区(TIR)二级结构。重组质粒转化JM109(DE3),以T7 RNA聚合酶-T7启动子调控转录。对288个重组子的β-gal活性测定表明,不同重组的表达量可相差55倍,其中9个表达量不同的重组子的RNA dot blot证实它们在转录水平无明显表达差异。由此提示,该研究策略和方法能有效地改变目的基因的TIR二级结构和捕获具有高翻译起始效率的表达克隆。     

条锈菌侵染初期小麦初生叶内可翻译mRNA的变化

小麦条锈菌毒性小种及其无毒性突变型侵染初期,是不亲和反应的小麦叶片内可翻译ｍＲＮＡ水平迅速增加,而呈亲和反应叶片的增加幅度小且滞后。同时前者的Ｐｏｌｙ（Ａ＋）－ＲＮＡ水平高于未接种对照,后者低于对照。３２Ｐ标记实验证实不亲和反应叶片Ｐｏｌｙ（Ａ＋）－ＲＮＡ的合成增加早于亲和反应叶片。Ｐｏｌｙ（Ａ＋）－ＲＮＡ体外翻译产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离后,放射自显影图谱显示一些多肽条带的３５Ｓ－Ｍｅｔ相对掺入量有定量差异。     

旋毛虫肌幼虫ES抗原的基因克隆及高效表达

作者对编码旋毛虫肌幼虫ES抗原的部分结构基因进行了克隆、鉴定和表达。用RNA PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫总RNA中反转录并扩增出0．7kh的靶DNA,酶切分析后将其克隆到融合表达载体pEx3lC中。SDS—PAGE电泳表明,含重组子的大肠杆菌能够表达出一分子量为37kDa的融合蛋白(P37),后者占菌体总蛋白的22%以上,并以包含体形式存在于菌体中。经对纯化后表达蛋白的ELlSA检测,证明它能被猪旋毛虫病阳性血清和抗旋毛虫单克隆抗体识别。研究结果揭示,重组蛋白P37对于研制旋毛虫病诊断抗原和免疫抗原具有潜在的应用价值。     

转化生长因子α－绿脓杆菌外毒素融合蛋白TGFα－PE40高效表达质粒的构建和表达

利用基因工程技术,将质粒pYX382用xbaI和EcoRl切下插入的TGFa—PE40融合 基因片段-连接到可表达载体pCB604的XbaⅠ／EcoR Ⅰ位点中,构建成新的重组质粒p2x—TP1。P2x—TP1转化E.coli BL2l感受志菌后,在ⅠPTG诱导下Ⅰpp启动子转录表达TGFα—PE40融合蛋白。表达产物主要以包涵体形式沉积在细胞内。融合蛋白表达量的高低与诱导时的细胞密度,诱导的温度以及培养基有关。在一定范围内与诱导剂的剂量以及诱导时间的长短无关。P2x—TPl重组质粒在工程菌中的表达TGFα－PE40融合蛋白量约为50mg／L。     

P53，Rb和c－myc基因在人脑原发性肿瘤中的转录表达

采用RNA斑点杂交分析,对21例人脑原发性胶质瘤和11例人脑膜瘤中p53,Rb和c-myc基因转录水平的表达进行研究.发现48.4%的肿瘤中p53基因表达减弱,21.9%的肿瘤中Rb基因表达减弱;71.9%的肿瘤中c-myc基因表达增强.在p53基因表达减弱的15例病例中有13例(80%)c-myc基因表达增强.结果表明,p53基因表达减弱和c-myc基因表达增强与人脑原发性肿瘤的发生有关.     

鲑鱼生长激素基因分泌型表达质粒的构建

生长激素(GH)是动物垂体前叶分泌的一种多肽类激素.应用分子重组及PCR等技术,构建了一种鲑鱼生长激素基因分泌型表达质粒pOsGH153,使编码鲑鱼生长激素成熟肽的序列克隆在大肠杆菌分泌型表达载体PIN-Ⅲ-ompA内,直接位于编码大肠杆菌外膜蛋白A信号肽序列的下游,在Lpp-Lac杂合启动子控制下,经IPTG诱导,分子量约23 000的鲑鱼生长激素在大肠杆菌中获得高效表达,该产物具有天然鲑鱼生长激素的免疫活性,直接分泌到细胞周质,而信号肽被自动剪除.     

人肾液泡型H~＋_－ATPase 58kD亚基基因的表达

在大肠杆菌中表达了人肾液泡型Ｈ￣＋－ＡＴＰａｓｅ５８ｋＤ亚基的基因,利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）得到了５８ｋＤ亚基的编码片段．直接将ＰＣＲ产物连接到ＰＥＴ载体上表达．ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析表明５８ｋＤ亚基的基因得到高效表达．表达产物可达细菌细胞质蛋白的５０％．     

生孢噬纤维粘菌M229内切葡聚糖酶基因的克隆与表达

生孢噬纤维粘菌(Sporocytophaga)M229可产内切葡聚糖酶(CMCase),外切葡聚糖酶(Avicelase)和β-葡萄糖苷酶(pNPGase)。以质粒pUC8为载体,采用CMC-刚果红法从M229中分离到了一个CMCase基因,导入E.coli JM83中后,其表达CMCase的活力为1.2×10^-2mU/mgpr,最适作用pH和温度分别为6—7和40—50℃。限制性图谱及亚克隆分析暗示,该CMCase结构基因内部     

外源GUS基因在PEG介导的花椰菜原生质体中的瞬间表达

为了将外源基因导入花椰菜原生质体获得转基因植株,本文研究了ＰＥＧ介导的外源基因在花椰菜下胚轴原生质体中的瞬间表达。（１）２０％ＰＥＧ将质粒ｐＢＩ２２１导入原生质体后ＧＵＳ表达比１３％ＰＥＧ导入的高,但易造成原生质体损伤。（２）热激处理增强表达,但在随后的培养过程中易造成原生质体降解。（３）原生质体状况对表达有重要影响,５ｄ龄下胚轴原生质体比８ｄ龄的表达强。（４）不同质粒及启动子表达强度不同。质粒ｐＫＩＷＩ１０１比ｐＢＩ２２１表达强３倍左右。