通过优化表达元件及培养基组分提高地衣芽胞杆菌中碱性丝氨酸蛋白酶产量

【背景】碱性丝氨酸蛋白酶(Subtilisin)是一种具有广泛用途的工业酶制剂。【目的】旨在通过优化启动子、信号肽及培养基组分来提高地衣芽胞杆菌中碱性丝氨酸蛋白酶产量。【方法】以地衣芽胞杆菌BL10为出发菌株,构建了含有4种不同类型启动子(PbacA、P43、PaprE和PsrfA)及4种不同类型信号肽(SPVpr、SPSacB、SPSacC和SPAprE)的碱性丝氨酸蛋白酶表达菌株,并在获得高产菌株的基础上进行培养基优化。【结果】4种启动子的表达水平为PbacAPaprEP43PsrfA,4种信号肽的分泌效率为SPAprESPSacCSPSacBSPVpr。其中,菌株BL10/pPbacA-aprE产生最高的碱性丝氨酸蛋白酶酶活(275.21 U/mL),相比于出发菌株BL10/pHY-aprE (167.98 U/mL)提高了64%。随后,通过对发酵培养基成分进行优化并结合正交优化,获得了一种高产碱性丝氨酸蛋白酶的培养基(g/L):玉米淀粉40.0,豆粕50.0,(NH4)2SO4 4.0,K2HPO4 3.0,CaCO3 1.0。最后,碱性丝氨酸蛋白酶酶活提高到747.37 U/mL,是初始酶活的4.45倍。【结论】为工业化高产碱性丝氨酸蛋白酶提供了一种有效策略。     

DDT降解菌株Chryseobacterium sp. PYR2对小麦的促生作用及其机理

【背景】前期结果表明,DDT降解菌株Chryseobacterium sp. PYR2可高效去除土壤中的DDT等污染物,具有潜在的应用价值,但该菌对植物的影响尚不清楚。【目的】探讨菌株Chryseobacterium sp. PYR2对植物的促生作用及其机理,为后续开发DDT降解及植物促生双效功能菌剂提供理论依据。【方法】配制该菌株的不同梯度稀释菌悬液,用纸卷发芽法和盆栽法研究菌悬液对小麦种子萌发和植株生长的影响;Salkowski法测定PYR2合成吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)量;单因素实验研究不同培养条件对菌株生长及IAA合成的影响;液相色谱-串联质谱-多反应监测(LC-MS/MS-MRM)方法分析IAA在PYR2菌体内的生物合成途径。【结果】PYR2菌悬液可明显提高小麦种子萌发率并促进小麦植株的生长,小麦的侧根数、株高、鲜重、干重等指标均明显提高。该作用是由于菌株PYR2可以合成植物生长激素IAA。最适IAA合成条件:温度30°C,pH 7.0-8.0,盐浓度0.5%,L-色氨酸50mg/L。代谢液中检测到色醇、色胺和吲哚-3-乙酰胺3种中间代谢产物,推测PYR2体内存在3条IAA合成途径,分别为吲哚-3-丙酮酸(IPy A)、TAM和IAM途径。【结论】菌株PYR2对小麦具有明显的促生效果,是由于其具有多条高效合成IAA的代谢途径,表明其在农药污染土壤的生物修复及作物种植中具有潜在的应用前景。     

生物表面活性剂鼠李糖脂对甘蔗黑穗病菌的体外抗菌活性

【背景】甘蔗黑穗病是一种主要的甘蔗病害,易造成甘蔗严重减产;鼠李糖脂是一种生物表面活性剂,可作为多种植物真菌病害的抑菌剂。【目的】研究生物表面活性剂鼠李糖脂对甘蔗黑穗病菌的体外抗菌活性及初步的抗菌机理。【方法】采用甘蔗黑穗病冬孢子萌发试验研究鼠李糖脂对甘蔗黑穗病冬孢子的抗菌作用。采用菌丝生长速率法和菌丝干重法对鼠李糖脂的体外抑菌试验进行检测;通过菌丝电导率的变化研究鼠李糖脂对甘蔗黑穗病菌细胞膜通透性的影响。【结果】鼠李糖脂能显著抑制甘蔗黑穗病菌孢子萌发,其中2.0 g/L鼠李糖脂对甘蔗黑穗病冬孢子萌发的抑制效果最好,抑制率达45.03%。鼠李糖脂能显著抑制甘蔗黑穗病菌双核菌丝体、单胞菌a和单胞菌b的生长。鼠李糖脂能使甘蔗黑穗病单胞菌细胞膜透性增加,与对照相比,2.0 g/L鼠李糖脂处理甘蔗黑穗病双核菌丝体0.5min后电导率升高了约9倍,处理单胞菌a30min后电导率提高了94.23%;0.1g/L鼠李糖脂处理甘蔗黑穗病单胞菌b30min后电导率升高了54.49%,随着浓度的增加,各处理电导率升高显著。【结论】鼠李糖脂对甘蔗黑穗病菌有良好的抗菌作用,有望为甘蔗黑穗病的防治提供新方法。     

4种理化因子对菌株XH1硝化效果的影响

【背景】基于硝化菌群的富集培养技术可高效稳定地去除养殖水体中的有害氮素,而当前在水产养殖领域有关硝化菌群定向培育及硝化功能菌株的研究较少。【目的】研究不同盐度、pH、温度、通气量条件下硝化菌群分离菌株XH1的生长及其对氨氮和亚硝氮的去除效果。【方法】设置不同梯度的盐度、pH、温度、通气量条件,通过计数菌量、测定氨氮及亚硝氮的浓度变化,比较不同条件下菌株XH1的生长及其对氨氮和亚硝氮的影响。【结果】菌株XH1可在盐度5‰-35‰、pH 6.0-9.0、温度15-45°C和通气量0.5-1 V/(V·min)的条件下生长良好,菌量最高可达2.34×109cells/mL;在盐度5‰-35‰、pH 6.0-9.0、温度15-30°C、通气量0.5 V/(V·min)的条件下,对氨氮的去除效果显著(P0.05),在第1-3天对培养液中氨氮的最高去除率可达86%-97%,但培养液中的氨氮浓度先降后升;对亚硝氮的最高去除率达68%。【结论】菌株XH1对盐度、pH、温度等主要环境因子具有良好的适应性,其对水体氨氮的去除效果良好,可作为中低盐度养殖池塘水体氨氮防控菌剂产品研发的备选菌株。     

贵州玉米籽粒镰刀菌污染情况调查

【背景】镰刀菌引起的作物病害在贵州省内时有发生,由于该地区低温高湿的气候特征并不适宜镰刀菌生长,之前未系统开展镰刀菌侵染和分布情况调查。【目的】调查贵州省玉米籽粒中镰刀菌病害的污染情况。【方法】收集贵州省58个县/县级市的玉米籽粒样品78份,利用原核表达的可用于检测镰刀菌的Fv SG7-AP融合蛋白对样品进行快速免疫学检测,并对部分样品进行生物学培养鉴定。【结果】共有67份样品检测结果为阳性,污染率高达85.90%,生物学培养后显微镜观察到镰刀菌菌丝和孢子。检测出镰刀菌污染的玉米样品分布在贵州省51个县/县级市,其中19个地区检测到轻度污染样品,20个地区检测到中度污染样品,12个地区检测到重度污染样品。【结论】贵州省绝大部分地区存在不同程度的镰刀菌污染,有必要在作物耕种、收获及贮藏期间采取有效的防控措施,以保障食品安全与人畜健康。     

铜绿假单胞菌表面(氧化)低密度脂蛋白配体的研究

【背景】研究发现铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)与(氧化)低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL/oxidized low density lipoprotein,ox LDL)具有特异性相互作用,有报道证实P. aeruginosa表达的Rah U蛋白可以与LDL/ox LDL特异性结合。【目的】验证Rah U蛋白是否是P.aeruginosa表面主要的LDL/ox LDL配体。【方法】大肠杆菌表达Rah U蛋白(r Rah U),ELISA验证r Rah U与LDL/ox LDL的相互作用。利用同源重组的方法构建RahU基因缺失突变株(ΔRahU菌株)作为阴性对照菌株,制备小鼠抗r Rah U抗体,经WesternBlot及ELISA分别检测抗r Rah U抗体与P.aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白的结合。通过ELISA方法对P. aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/ox LDL的结合差异进行比较,并对不同蛋白酶水解ΔRahU菌体表面蛋白后ΔRahU菌株与LDL/ox LDL结合能力的差异进行比较。【结果】经ELISA验证rRahU与LDL/oxLDL存在特异性结合。Western Blot及ELISA方法证实小鼠抗rRahU抗体可以与P. aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白特异性结合,而不与ΔRahU菌株相互作用。P.aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/oxLDL结合能力无显著差异,且蛋白酶水解后ΔRahU菌株与LDL/oxLDL的结合能力相近。【结论】RahU蛋白是P. aeruginosa表面的LDL/oxLDL配体之一,但不是唯一的配体。     

鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株的构建及其对抗生素敏感性分析

【背景】沙门菌的多重耐药现象日渐严重,对其耐药机理的研究尤为迫切,双组分系统与细菌耐药性密切相关。【目的】构建鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株及回补株,探究双组分系统BaeSR对鼠伤寒沙门菌耐药性的影响。【方法】以鼠伤寒沙门菌体外诱导耐药株CR为研究对象,通过自杀质粒p LP12介导的同源重组方法,以氯霉素抗性标记和阿拉伯糖诱导的致死基因vmt进行正、反向双重筛选,获得基因缺失株CRΔbaeSR,并将重组表达质粒pBAD-baeSR转化于CRΔbaeSR构建回补株CR CΔbaeSR。采用微量肉汤稀释法测定11种常见代表药物对野生株、缺失株及回补株的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),并测定3株菌的生长曲线、运动性及生物膜形成能力。【结果】与野生株相比,环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)、头孢噻呋(CEF)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、安普霉素(APR)对缺失株的MIC值有所下降;缺失株的生长速率稍显缓慢,且最终浓度也相对较低,但并无统计学上的显著差异(P0.05);缺失株的运动性(P0.05)及生物膜形成能力(P0.01)均显著下降。【结论】鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失后,可通过影响其运动性及生物膜形成能力而对抗生素的敏感性产生影响。     

水拉恩氏菌JZ-GX1产嗜铁素特性及其对林木病原菌的拮抗作用

【背景】嗜铁素被认为是一种具有开发和利用价值的新型生物活性物质,已被逐渐应用到植物病原菌的防治中。【目的】明确根际促生菌水拉恩氏菌(Rahnella aquatilis) JZ-GX1产嗜铁素最佳发酵培养条件,进一步探讨嗜铁素在防治植物根部病害中的潜在作用。【方法】采用摇瓶发酵法,通过铬天青(Chrome azurol S,CAS)检测分析,对影响JZ-GX1菌株嗜铁素分泌的几种发酵因子进行研究,并通过菌丝生长抑制速率法测定嗜铁素对两种林木病原菌的拮抗效果。【结果】以KMB为基础培养基,初始pH 8.0,装液量25 mL/50 mL,按1%接种量接种,在28°C下培养36 h可获得该菌株较高产量的嗜铁素;鉴定其嗜铁素类型为羧酸盐和异羟肟酸型的复合型铁载体;在最适条件下测得其发酵原液对樟疫霉(Phytophthoracinnamomi)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的抑制率均达到100%。【结论】水拉恩氏菌JZ-GX1对碱性土壤上林木根部病害的防治具有较好的潜力。     

禽大肠杆菌、肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌多重PCR方法的建立及应用

【背景】大肠杆菌病和沙门菌病是最常见的家禽细菌性疾病,给养禽业造成严重经济损失。另外,禽大肠杆菌和沙门菌也是重要的人畜共患病原菌,可通过禽类及其产品传播给人类,对人类健康造成严重威胁。加强禽大肠杆菌和沙门菌的快速鉴别检测,对养禽业和公共卫生都具有重要意义。【目的】建立禽大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的多重PCR检测方法。【方法】通过比较分析确定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的特异靶标基因,设计5对特异性引物,通过条件优化建立多重PCR方法,分析该多重PCR方法的特异性、敏感性及可靠性。【结果】该方法能特异性地鉴定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌,每个PCR反应的最低检出限分别为103 CFU细菌和100 pg基因组DNA。临床分离菌株检测显示,多重PCR与传统血清学方法结果一致。【结论】建立的多重PCR方法能够快速鉴别禽致病性大肠杆菌和不同血清型沙门菌,对禽大肠杆菌病和沙门菌病的流行病学调查及临床检测具有重要意义。     

不同年龄大熊猫肠道可培养芽孢杆菌的多样性及部分功能特性分析

【背景】大熊猫的肠道内微生物类群丰富,种群结构与宿主的年龄、生存环境、季节变化等因素有关,其中年龄是影响肠道菌群组成的重要因素之一。【目的】以不同年龄阶段的大熊猫粪便为研究对象,旨在了解不同年龄大熊猫肠道内芽孢杆菌的多样性,探究大熊猫肠道芽孢杆菌种类与年龄段之间的关系,并为优良益生菌剂的开发提供菌种资源。【方法】用稀释涂布法分离大熊猫粪便中的芽孢杆菌,对分离的菌株进行BOXA1R-PCR、16S rRNA基因系统发育及主成分分析,揭示大熊猫肠道中可培养芽孢杆菌的多样性;采用对峙生长法和药敏纸片琼脂扩散法分别检测菌株的抗菌能力和药敏性。【结果】从大熊猫粪便中共分离出90株芽孢杆菌,基于BOXA1R-PCR分析菌株的遗传多样性并从中选取41株代表菌株,经16Sr RNA基因测序分析后,结果显示归属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)6个种;主成分分析结果表明大熊猫肠道芽孢杆菌种群组成与年龄存在一定的相关性。所有的供试菌株都具有纤维素降解潜力,大部分菌株对病原菌具有不同程度的抑制作用;除对青霉素具有耐药性外,供试菌株对常见的抗生素耐受性低。【结论】年龄是影响大熊猫肠道芽孢杆菌分布的重要因素,成年大熊猫肠道芽孢杆菌种类多样性最丰富,这为大熊猫益生菌制剂的开发提供了菌种资源。