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91.
将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyAm重组于大肠杆菌表达载体pET30b(+),以重组表达载体pET30b-F-phyAm为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyAe(在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-F-phyAm载体上13氨基酸残基)。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyAe在GS115酵母中表达。纯化的突变酶PP-NP-e与野生型酶PP-NP-m8相比:PP-NPAe的最适反应温度上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高21%,比活力略有提高。最适反应pH为5.6,有效pH范围pH4.6到pH6.6。比未突变酶扩大了0.4单位。 相似文献
92.
人 Ⅹ型磷脂酶 A2 在大肠杆菌中的表达产物完全以不溶的包涵体形式存在 . 用以前适用于人胰型 (IB 型 ) 磷脂酶 A2 的稀释重折叠方法,并不能使它有效重折叠 . 以初步纯化的包涵体为对象,发现溶液的温度、 pH 值和蛋白质浓度对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 体外重折叠有很大的影响 . 研究了一些小分子化合物对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 ,在高蛋白质浓度 (1 g/L) 下重折叠的影响,发现 1 mol/L 的 L- 精氨酸能提高其重折叠效率达 6 倍多 . L- 精氨酸的结构类似物 L- 瓜氨酸对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 的重折叠有较弱的改善,而 L- 赖氨酸和 L- 精氨酸甲基酯则降低了 Ⅹ 型磷脂酶 A2 的活性恢复 . 结果表明 , L- 精氨酸对蛋白质重折叠的帮助作用,可能是通过精氨酸与折叠中间物的结合产生的,精氨酸的胍基和羧基都是必需的,其侧链胍基以其特殊的带电方式阻遏了重折叠过程中的积聚和分子间二硫键形成的反应 . 相似文献
93.
94.
抗人VEGF受体Ⅱ基因Ⅲ区单链抗体基因的构建和表达 总被引:3,自引:0,他引:3
采用RT-PCR技术从分泌抗人血管内皮生长因子受体Ⅱ(kinase insert domaincontaining receptor,KDR)基因Ⅲ区单克隆抗体Ycom1D3的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,通过重叠延伸拼接(spliceoverlap extension)PCR方法在VH和VL基因之间引入柔性短肽(Gly4Ser)3,体外构建Ycom1D3单链抗体基因Ycom1D3-ScFv),将其克隆至pAYZ表达载体,在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明,Ycom1D3-ScFv在E.coli 16C9中获得表达,重组蛋白的相对分子量为30kD,与预期结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,TALON 金属亲合层析基质(TALON metal affinity resin)纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实该单链抗体可与人脐静脉内皮细胞结合,保留了鼠源单抗与KDR抗原的特异性结合活性。抗KDRⅢ单链抗体基因Ycom1D3-ScFv的成功构建和功能性表达为靶向诊断治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。 相似文献
95.
96.
猪α1-干扰素的基因改造与高效原核表达 总被引:15,自引:0,他引:15
poIFNα1基因中含有大量的大肠杆菌稀有密码子,为了获得高表达,使用了大肠杆菌的偏爱密码子,人工合成了poIFN|α1成熟蛋白编码基因。在保留编码蛋白序列的同时,使其5′端A+T的含量增加到最大限度,并将其终止密码子改为TAA。将合成的poIFNα1成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体pRLC中,转化大肠杆菌DH5α。实现了poIFNα1在大肠杆菌中的高效表达,表达产物以包涵体形式存在。纯化的包涵体经含DTT的6 mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSHGSSG的复性液复性处理,复性后的表达产物浓缩后经凝胶层析纯化,细胞病变抑制法测定表明,重组poIFNα1具有较高的抗病毒活性,约为6.4x106u/mg。
相似文献
97.
μ型阿片受体是阿片类药物镇痛与成瘾的分子基础。从人脑组织总RNA通过RTPCR扩增获得μ型阿片受体的cDNA,将其克隆至pcDNA31(+)中,用酶切鉴定正确的重组质粒转染CHO细胞。筛选的单克隆细胞株,检测阳性的细胞克隆表达的μ型阿片受体介导胞内信号转导的能力。通过与激动剂和拮抗剂的信号转导分析证实,阳性的细胞克隆表达的μ型阿片受体与天然的μ型阿片受体具有基本一致的生物学特性,因此可以用来作为高效镇痛低成瘾药物筛选平台的候选细胞株。 相似文献
98.
99.
为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ(hTopo Ⅰ)为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopo Ⅰ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达,表达产物可分泌到发酵上清,易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母(SMD-hTopoI)分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母(X33-hTopoI和KMhTopoI)更高。通过发酵条件的优化,使用BMMY(pH 7.25),于20℃,每隔24h补加0.5% (V/V)的甲醇和3% (V/V)的营养液,SMD-hTopo Ⅰ诱导72h后可表达最高的酶活力(43000u/mL),发酵上清中hTopo Ⅰ可达11 mg/L,约占总蛋白的10%。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达的hTopo Ⅰ为91kD蛋白,无糖基化修饰。 相似文献
100.
抗转铁蛋白受体单链抗体的可溶性表达及其对脑的靶向性研究 总被引:5,自引:1,他引:4
分段合成大鼠抗转铁蛋白受体单链抗体基因(ox26-scFv),经三轮PCR拼接成794bp的完整片段。测序后构建pTIG-Trx/ox26-scFv表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,经Ni-NTA金属鏊合层析柱纯化,在29 kD处可见单一条带。大鼠GH3细胞免疫组化显示,该单链抗体能识别并与转铁蛋白受体结合。将单链抗体尾静脉注射大鼠,于鼠脑组织切片上可见阳性染色,尤其是脑血管处着色明显,说明该单链抗体对脑血管具有较好的靶向作用,并在受体的介导下通过了血脑屏障。 相似文献