重组人纤溶酶原基因的酵母表达、产物纯化及鉴定

目的: 研究重组人纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域（rhPLG-SP）的酵母表达、纯化及理化性质。 方法:采用7.5 L发酵罐对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌 rhPLG-SP/GS115 进行高密度培养、甲醇诱导表达rhPLG-SP,培养液经三步纯化：超滤、Sephacryl S-100、SP-Sepharose FF,将活性组分透析后冷冻干燥。等点聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测 rhPLG-SP等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S-2403 分别测定 rhPLG-SP激活后的纤维蛋白溶解和酰胺水解活性。结果: 7.5 L高密度发酵可获得约为400mg/L培液的表达量,经三步纯化后制备的rhPLG-SP纯度大于96%。理化分析显示 rhPLG-SP的等电点为7.5~7.8,分子量：27 877 Da,比活性：23.6U/mg。结论: 初步建立了rhPLG-SP酵母工程菌的高密度培养、表达及纯化工艺,所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近,具备放大生产和应用的潜力。     

谷精草抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究

研究谷精草中α-葡萄糖苷酶活性抑制成分。采用色谱技术分离鉴定了26个化合物,对所有分离得到的化合物都进行了抗α-葡萄糖苷酶活性的体外筛选试验。其中化合物决明内酯-9-O-β-D-葡萄糖苷(3)、万寿菊素(7)、1,3,6,8-四羟基-2-甲氧基口山酮(13)、万寿菊素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(19)显示出显著的抑制活性,IC50分别为106.7、8.73、56.6、80.4μM。     

Scirpusin A和scirpusin B体外抗人类免疫缺陷病毒1型的作用

Scirpusin A和scirpusin B是从药用植物中发现的2种天然茋类二聚体,具有一定的抗病毒效应。本研究利用人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜和水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜的HIV假病毒及实验室适应株HIV-1ⅢB,在体外评价2种药物的抗病毒效果并初步探讨其作用机制。研究发现,scirpusin A和scirpusin B不仅能在体外有效抑制HIV假病毒感染TZM-bl细胞(一种HIV-1易感细胞),还能抑制实验室适应株HIV-1ⅢB。Scirpusin B的作用优于scirpusin A。对实验室适应株HIV-1ⅢB,scirpusin B的半数抑制浓度(IC50)为1.33μmol/L,scirpusin A的IC50为4.77μmol/L。此外,scirpusin A和scirpusin B还能抑制VSV-G包膜假病毒,提示其作用可能与病毒在细胞内的复制过程相关。Scirpusin A在病毒进入细胞后仍可发挥抑制作用,但具体机制尚待深入研究。     

重组K-Ras突变基因在胰腺癌Bxpc-3细胞株中的表达及其对化疗药物药效的影响

K-Ras是Ras基因家族中的一员,在细胞生存、增殖和分化过程中发挥重要作用.当Ras基因发生突变时,其表达的Ras蛋白可能被过度激活,从而导致肿瘤的产生和发展.胰腺癌中K-Ras的突变频率较高,但其对胰腺癌化疗药物药效的影响尚不明确.本文以p Ac GFP1-C3质粒为载体构建了含有5种不同基因型K-Ras序列的重组质粒,分别为野生型和G12V,G12R,G12D,G13D 4种突变型.将上述重组质粒转入人胰腺癌Bxpc-3细胞株并筛得稳转株.结果显示,转染野生型和突变型K-Ras的细胞株具有相似的生长速度,且细胞中K-Ras-GFP融合蛋白的表达量也一致.药效学研究显示,转染突变型K-Ras基因的细胞对吉非替尼、5-氟尿嘧啶、多西他赛和吉西他滨的药物敏感性降低,而对厄罗替尼和顺铂的药效则无显著影响,这可能与转染突变型K-Ras基因的细胞中K-Ras下游信号p-Akt和p-Erk的水平升高有关.此外,转染不同突变型K-Ras导致的药效及p-Akt,p-Erk的表达变化也不同.体外研究结果表明,K-Ras突变细胞对多种化疗药物的药效敏感性降低,同时不同突变型细胞之间药效也有差异,该结果有待进一步深入研究.     

金丝桃属植物化学成分研究进展

到目前为止,已从金丝桃属植物中分离得到300多种化合物,主要特征化学成分为萘骈二蒽酮、间苯三酚、酮和黄酮等类型化合物;也含有香豆素、苯丙素、萜类和挥发油等其它类型的化学成分。本文按照化合物结构类型进行了归纳,综述了该类植物的化学成分研究进展,同时简述了这些成分的相关药理作用。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA252辅酶A二硫化物还原酶缺失延缓苯唑西林的次级损伤效应

【目的】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在苯唑西林作用下,其辅酶A二硫化物还原酶表达上调2.3倍。本文研究苯唑西林对该酶缺失的金黄色葡萄球菌的杀菌效应。【方法】利用同源重组双交换技术对金黄色葡萄球菌进行基因敲除,并用质粒p OS1构建回补株;采用分光光度法检测菌株体外增殖能力;以时间-杀菌法考察苯唑西林对菌株杀菌效应;以2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐为探针检测胞内活性氧水平。【结果】辅酶A二硫化物还原酶基因敲除株较亲株生长缓慢(P0.05);20倍MIC浓度苯唑西林下敲除株的时间-杀菌曲线及胞内活性氧水平与亲株无显著性差异,5倍MIC浓度下敲除株的致死速率及胞内活性氧水平均较亲株下降。【结论】在较低浓度苯唑西林作用下,辅酶A二硫化物还原酶基因缺失降低胞内活性氧水平,减小杀菌速率,延缓次级损伤效应。     

实时荧光核酸恒温检测技术（SAT）在甲型流感病毒动物模型检测中的应用

评价实时荧光核酸恒温检测技术（SAT）对H1N1和H3N2两种甲型流感病毒小鼠模型肺组织匀浆液的检测效能。小鼠滴鼻感染不同浓度H1N1、H3N2病毒液30μL,感染96h后取肺组织匀浆液分别进行SAT检测及抗原血凝效价测定。结果表明,SAT检测的病毒拷贝数基本与抗原血凝效价测定结果一致,但灵敏度提高10^4倍。与血凝实验比较,SAT检测具有灵敏度高、特异性强、结果准确、高通量自动化的优势,有利于甲型流感动物模型的建立,为实验室筛选抗甲型流感病毒药物奠定基础。     

大花红天素分离、合成及其含量分析

研究大花红天素的分离、合成,并对大花红天素的含量进行分析测定。通过东京化成HP-20和硅胶柱色谱进行分离;以2-甲基-3-丁烯-2-醇和溴代四乙酰葡萄糖通过SN2反应合成大花红天素,合成收率为18％;通过HPLC-ELSD对大花红天素的含量进行分析,通过对8种样品的分析,测定大花红景天和红景天饮片中分别含大花红天素2．06％、0.83％,其他样品中未检出大花红天素。作者对大花红天素进行了首次合成并建立了相应的分析测定方法。     

α1-抗胰蛋白酶的分离纯化

为建立从Cohn's组分IV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)的技术路线,以Cohn's组分IV为原料,利用还原剂1,4-二硫苏糖醇(DTT)、气相二氧化硅等处理,再经压滤、离子交换层析和疏水层析提取α1-AT.用SDS-PAGE及合成基质法检测α1-AT的纯度以及生物活性.结果可见,Cohn组分IV沉淀中α1-AT占蛋白总量的11%～13%,经该工艺提取的α1-抗胰蛋白酶纯度为97.6%,疏水层析后α1-AT的收获率为21%,比活为每毫克总蛋白中含 0.54 mg功能活性α1-AT.可见用此方法从Cohn组分IV沉淀中可制备高纯度的α1-AT.     

无标记（Marker—Free）：转基因植物研究的新趋势

目前 ,几乎所有的植物遗传转化中都要使用选择性标记基因诸如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子。为了消除由此而引起的公众的安全性顾虑 ,一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因植物应运而生。无选择标记的转基因植物具有许多独特的优势 ,如消除大众对转基因植物中含有选择标记基因而引起的恐惧及可以反复地向已转化的植物中叠加外源基因等 ,因此 ,这种新策略 (无标记 )有着巨大的应用潜力。本文对获得无标记转基因植物的一些途径做一综述。