慢病毒介导双shRNA靶向于HIV的抑制作用研究

RNA干扰可以有效地抑制特定基因的表达,在HIV基因治疗中成为一种重要的方法。为了防止病毒逃逸株的出现,本研究分别构建了靶向于HIV-1调控蛋白基因vpr和tat的shRNA重组慢病毒载体以及含有这两种shRNA的双表达重组慢病毒载体,分别由U6和H1两种启动子启动,通过与靶向基因tat和vpr表达质粒在293T细胞中进行共转染,采用荧光定量PCR方法测定细胞内靶向基因的表达丰度,结果显示双表达shRNA的重组慢病毒载体对vpr和tat的表达抑制率分别可以达到89.20%和62.00%。与pNL4-3病毒包装质粒共转染,P24ELISA显示plvx-vpr-tat shRNA对病毒包装产量的抑制率可以达到99.05%,比单个shRNA的抑制率都要强,HIV-1NL4-3体外对MT4细胞攻毒实验表明双shRNA重组慢病毒载体具有很强的抑制病毒复制的能力。     

植物LTR反转录转座子的研究进展

反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的遗传因子,它们以RNA为媒介,在基因组中不断自我复制。在高等植物中,反转录转座子是基因组的重要成分之一。反转录转座子可以分为5大类型,其中以长末端重复（LTR）类型报道较多。LTR类型由于其首尾具有长末端重复序列,内部含有PBS、PPT、GAG和POL开放阅读框、TSD等结构,可以采用生物信息学软件进行预测。LTR反转录转座子的活性受到自身甲基化和环境因素的影响,DNA甲基化抑制反转录转座子转座,而外界环境的刺激能够激活转座子,从而影响插入位点周边基因的表达。同时由于LTR反转录转座子在植物中普遍存在,丰富的拷贝数以及多态性为新型分子标记（RBIP、SSAP、IRAP、REMAP）的开发提供了良好的素材。该文对近年来国内外有关植物反转录转座子的类型、结构特征、 LTR反转录转座子的活性及其影响因素、 LTR反转录转座子的预测以及标记开发等方面的研究进展进行综述。     

超声波介导的微生物细胞转化

随着分子生物学的发展, 微生物遗传改造越来越广泛地应用在微生物育种、临床医学、环境保护等方面。其中, DNA转化技术经常是高效遗传改造的瓶颈之一。应用超声波将目的基因导入微生物细胞的技术具有原位、多尺度、活体、高通量、低成本等优点, 因此发展较为迅速。其原理是超声波可以通过声学气穴现象产生一系列的非热能效应, 而声学气穴微泡可产生短暂的细胞膜透化作用。本文综述了超声波转化的基本原理及其在微生物细胞转化中的发展现状, 并结合本实验室应用超声波转化法转化革兰氏阳性菌等研究进展, 分析了其特色、优势及现存挑战。     

KLF2 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis and inflammation with regulation of AP-1

Pulmonary fibrosis (PF) is a chronic, fibrosing interstitial pneumonia and devastating disease. Here we investigated the potential roles of Kruppel-like factor 2 (KLF2) on pulmonary fibrosis and inflammation response. A mouse model of pulmonary fibrosis was established by intratracheal injection of bleomycin (BLM). The mRNA and protein levels of KLF2 were assayed by RT-PCR and Western blotting respectively. The extent of lung fibrosis was determined using hematoxylin and eosin (HE) staining and Masson's trichrome staining, and the hydroxyproline content was quantified. RT-PCR was used to evaluate the mRNA expression of collagen type 1a1 (col1a1), col3a1, α-SMA, TNF-α, IL-1β and IL-6. The concentrations of TNF-α, IL-1β, and IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue were examined by ELISA. Also, the effects of KLF2 on activator protein-1 (AP-1) were evaluated by measuring the c-Jun and c-Fos protein levels. We found that KLF2 was remarkably downregulated in BLM-treated rats, both in mRNA and protein levels. Additionally, overexpression of KLF2 attenuated the destruction of the alveolar space and pulmonary interstitial collagen hyperplasia, and deposition reduced the expression of col1a1, col3a1, and α-SMA, and blocked the production of TNF-α, IL-1β, and IL-6 in BALF and lung tissue in vivo. Moreover, adenoviral transduction of KLF2 inhibited TGF-β1-induced expression of col1a1, col3a1, and α-SMA in vitro. Mechanically, BLM up-regulated c-Jun and c-Fos expression, which was impeded by KLF2 overexpression. Taken together, our data indicate that KLF2 attenuates pulmonary fibrosis and inflammation, possibly through the regulation of AP-1.     

X射线衍射晶体法解析脱卤酶DehDIV-R结构的研究

R-2-卤代酸脱卤酶能立体选择性水解R-2-卤代酸。解析酶的单晶结构对提高酶的选择性和活性提供了直接的结构指导,是目前酶结构领域研究的前沿。以实验室前期得到的来自假单胞菌ZJU26的R-2-氯丙酸脱卤酶(Deh DIV-R)为研究对象,采用X射线衍射晶体法进行结构解析。采用pp SUMO载体融合表达Deh DIV-R蛋白,依次通过Ni-NTA亲和层析、透析酶切、二次NiNTA亲和层析以及凝胶过滤层析纯化得到单一条带,且均一性好的蛋白。接着对结晶条件进行初筛与优化,得到的最佳结晶条件为0.1mol/L HEPES p H 7,12%PEG 6 000,0.2mol/L Mg Cl2,8mmol/L CHAPS。晶体在上海同步辐射光源BL18U1线站上收集衍射数据,采用分子置换法成功解析获得了分辨率为2.35的Deh DIV-R的晶体结构。Ramachandran图表明98.02%的氨基酸位于最适区,证明了该结构的合理性。Deh DIV-R的纯化、结晶以及结构解析为进一步深入了解其结构和功能奠定了基础。     

根际促生菌对石漠化地区造林苗木的促生效应

西南岩溶石漠化山区水土流失严重、养分贫瘠,导致植被恢复困难。为探究固氮菌对岩溶石漠化地区造林苗木的生长促进效应,该文以广西石漠化地区常见造林树种香樟、任豆、喜树和台湾相思苗木为材料,利用平板稀释法从石漠化乡土植物根际土壤筛选固氮菌,通过测定固氮酶活性及鉴定固氮菌菌种,选择固氮酶活性较高的菌种制成复合菌剂接种到试验苗木进行盆栽试验。结果表明:共筛选得到6株具有固氮能力的根际促生菌,分别属于根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和黄杆菌属(Flavobacterium),其中归类为根瘤菌属的3株固氮菌酶活性较高。复合菌剂接种试验表明接种固氮菌对造林苗木的生长具有明显促进作用。与未接种处理相比,接种处理苗木的株高、叶面积、生物量以及叶绿素含量均显著增长;同时苗木的氮、磷、钾含量也有不同程度的增加。其中,香樟、任豆、喜树和台湾相思的氮含量分别提高了28.9%、53.1%、37.0%和31.6%;香樟、台湾相思的磷含量分别增加了25.6%和42.5%;任豆、台湾相思的钾含量分别增加了57.5%和49.7%。接种石漠化乡土固氮菌能够显著促进造林苗木生长和养分含量,在石漠化植被修复中具有较好的应用前景。     

重组人TNFR-Fc基因水稻种子特异表达载体构建

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)在治疗系统性自身免疫疾病中有很好的功效。目前TNFR-Fc主要通过动物细胞系生产,高昂的成本限制了其大规模应用。使用水稻种子作为生物反应器有望大幅度降低TNFR-Fc的生产成本,提供优质足量的目标产品。为使TNFR-Fc基因能够在水稻中高效表达,该研究拟构建经水稻偏好密码优化的TNFR-Fc基因的种子特异表达载体。通过对水稻和人全基因组密码子使用偏好性进行比较分析并按照水稻最优密码对TNFR-Fc氨基酸序列进行逐一优化,命名为Rf TNFRFc,通过全基因合成法制备该基因片段;同时采用PCR法扩增水稻种子特异表达启动子Glu-4,构建种子特异表达启动子驱动的Rf TNFR-Fc基因表达载体。结果表明:水稻与人多数氨基酸中密码子使用偏好性较为一致,但在L、S、P、R这4种氨基酸的密码子使用偏好性差异较大,优化时对这些密码子进行逐一替换,优化后30.8%的氨基酸密码子发生了变化;PCR扩增获得种子特异启动子,并连接至p CAMBIA1381载体,同时将全基因合成法制备的Rf TNFR-Fc基因连入该载体,PCR、双酶切验证及测序分析表明载体成功构建。该研究构建的Rf TNFR-Fc基因种子特异表达载体,为在水稻种子中大规模生产TNFR-Fc奠定了基础。     

土壤氮磷化学计量特征对小麦光合气体交换参数和叶绿素荧光参数的影响

选取‘镇麦168’为实验对象,采用盆栽实验,设置16个不同土壤氮磷梯度,测定不同土壤氮磷化学计量比处理下小麦叶片叶绿素含量、光合气体交换参数和叶绿素荧光参数的响应特征,以揭示不同土壤氮磷化学计量关系对小麦叶片光合特性影响的生理生态机制。结果表明:(1)不同生育期内小麦叶片叶绿素含量均随土壤速效N或速效P含量的增加而增加。(2)随着土壤化学计量比N∶P下降,小麦叶片净光合速率(Pn)在土壤中低氮水平(≤258.4mg·kg~(-1))下持续增加,在高氮水平(308.4mg·kg~(-1))下则呈现先增后降的趋势。(3)在土壤速效N相同水平处理下,土壤化学计量比N∶P的降低显著提高了小麦叶片叶绿素荧光参数最小荧光(F0,7.27%~20.00%)、最大荧光(Fm,5.28%~16.15%)、光化学猝灭系数(qP,6.64%~20.92%)及实际光化学效率(ΦPSⅡ,6.95%~18.82%),显著降低了非光化学猝灭系数(NPQ,7.42%~25.63%,P0.05)。研究认为,在中、高氮磷养分水平下,土壤化学计量比N∶P为2.88时,‘镇麦168’叶片净光合速率和实际光化学效率均达到最高水平,表现出较强的光能利用能力。     

沙埋对干旱沙区生物结皮覆盖土壤温室气体通量的影响

以腾格里沙漠东南缘自然植被区生长的两种典型生物结皮——藓类和藻类-地衣混生结皮覆盖土壤为对象,通过设置0(对照)、1 mm(浅层)和10 mm(深层)沙埋处理,研究了沙埋对该区结皮覆盖土壤温室气体通量的影响,并通过测定沙埋后土壤温度、水分的变化,初步探讨了沙埋影响生物结皮覆盖土壤温室气体通量的环境机制.结果表明: 沙埋显著增加了两类结皮覆盖土壤的CO₂释放通量和CH₄吸收通量(P<0.05);但对N₂O通量的影响因沙埋厚度和结皮类型的不同而异:深层沙埋(10 mm)显著增加了两类结皮覆盖土壤的N₂O吸收通量,浅层沙埋(1 mm)仅显著降低了藓类结皮覆盖土壤的N₂O吸收通量,而对混生结皮覆盖土壤的N₂O通量影响不显著.沙埋显著增加了两类结皮覆盖土壤的表层温度和0~5 cm深土壤湿度,从而增加了其CO₂释放通量.但是沙埋引起的土壤温湿度的变化与CH₄和N₂O通量变化的相关性不显著,说明沙埋引起的土壤温湿度变化不是影响其CH₄和N₂O通量的关键因子.     

蘑菇渣堆肥对华北落叶松移植容器苗生长和营养积累的影响

为缓解草炭大量使用带来的环境问题,在华北落叶松容器育苗过程中添加蘑菇渣堆肥以替代草炭,添加蘑菇渣堆肥体积比例分别为0%(T₀)、15%(T₁)、18.75%(T₂)、25%(T₃)、37.50%(T₄)、50%(T₅)、56.25%(T₆)、60%(T₇),研究不同配比下基质的理化性质以及对华北落叶松1年生移植容器苗生长和营养积累的影响.结果表明: 当蘑菇渣堆肥替代草炭的比例≤50%时,苗木苗高、地径和生物量与常用草炭处理无显著差异,且处理T₂、T₄、T₅苗木体内养分浓度显著高于对照,基质pH值处于微酸性或中性范围,适宜苗木生长;当蘑菇渣添加比例＞50%时,基质pH值偏碱性,苗木生长受到不利影响,苗木质量下降.当蘑菇渣添加比例为15%时,苗木质量最好,苗高、地径和单株生物量达到最大.因此,蘑菇渣替代草炭培育华北落叶松移植容器苗是完全可行的,替代比例最高可达到50%,当添加比例为15%时,可培育出高质量的苗木.