HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

离体条件下葡萄砧木＇5BB＇植株再生体系研究

以葡萄砧木＇5BB＇组培苗为试材,研究不同外植体类型、基本培养基、植物生长调节剂的种类及其浓度组合对＇5BB＇植株再生的影响.结果表明：MS基本培养基为适合叶柄不定芽再生的基本培养基;着生于顶端第2、3节位的叶柄为适宜的外植体;适于叶柄不定芽再生的植物生长调节剂种类及质量浓度组合为2.5 mg/L BA＋0.05mg/L IBA;叶柄不定芽再生率最高可达到43.33%.     

Bacillus halodurans菌株xynM基因的克隆、表达和序列分析

目的:用2株新分离鉴定的细菌克隆与最近源种(Bacillus halodurans C-125)木聚糖酶基因的同源序列,并对其进行序列分析。方法:根据已发表的近源种(C-125)的保守区序列设计引物,扩增出与其同源的木聚糖酶基因,进而用pQE31载体对该基因进行表达。同时对表达蛋白的三维空间结构进行网络模拟分析,对蛋白同源性进行比对分析。结果:克隆的木聚糖酶基因片段分别为1284bp和1236bp,而且该基因也成功表达;该蛋白是(α/α)6折叠构象,与C-125三者同属于一个分支上。结论:通过分析、表达蛋白编码外切-1,4-β-木聚糖酶,属于M家族。这该新分离菌株木聚糖酶的研究和应用提供了重要线索。     

南海北部浮游桡足类对浮游植物的摄食压力

于2004年2月(冬季)和8月(夏季)在南海北部使用肠道色素法研究了浮游桡足类群落对浮游植物现存量的摄食压力。将底到表垂直拖网(网孔径200μm)获得的桡足类分为中型(>500μm)和小型(200~500μm)两个体长组。冬季:中型桡足类的丰度为103~2343(平均633)ind/m3,肠道色素为0.15~2.71(平均1.31)ng/ind,肠道排空率为0.011(A4)~0.019(C1)min-1,个体摄食率为3.13~58.48(平均28.36)ng/(ind.d),群落摄食率为1902~62369(平均18679)ng/(d.m3),对浮游植物生物量的摄食压力为每天0.25%~6.39%(平均3.04%)。小型桡足类的丰度为418~6250(平均1691)ind/m3,肠道色素为0.18~3.44(平均1.19)ng/ind,肠道排空率为0.012(A4)~0.016(C1)min-1,个体摄食率为3.67~70.04(平均24.34)ng/(ind.d),群落摄食率为1540~158561(平均44227)ng/(d.m3),对浮游植物生物量的摄食压力为每天0.44%~15.70%(平均6.59%)。浮游桡足类群体对浮游植物生物量的摄食压力为每天1.02%~20.10%(平均9.63%)。夏季:中型桡足类的丰度为111~1298(平均621)ind/m3,肠道色素分别为0.22~1.58(平均1.03)ng/ind,肠道排空率为0.017min-1,个体摄食率为5.52~39.92(平均25.95)ng/(ind.d),群落摄食率为4411~26667(平均12878)ng/(d.m3),对浮游植物生物量的摄食压力为每天0.23%~6.52%(平均2.52%)。小型桡足类的丰度为756~8804(平均2990)ind/m3,肠道色素含量为0.09~2.92(平均0.87)ng/ind,肠道排空率为0.020min-1,个体摄食率为2.73~87.77(平均26.26)ng/(ind.d),群落摄食率为9309~139817(平均47191)ng/(d.m3),对浮游植物生物量的摄食压力为0.86%~37.79%(平均10.99%)。浮游桡足类群体对浮游植物生物量的摄食压力为1.09%~39.95%(平均13.51%)。数据表明,2月份和8月份桡足类群体对浮游植物现存量的摄食压力较低,桡足类摄食不是南海北部浮游植物死亡的主要原因。     

阻断子宫动脉建立FGR大鼠模型的研究

目的通过暂时阻断妊娠期大鼠子宫血供的方法建立子宫缺血引起胎儿生长受限的动物模型。方法根据大鼠子宫动脉是卵巢动脉的一个分支的解剖特点,于孕鼠妊娠第15天时施行手术暂时阻断卵巢动脉并于第21天行剖宫产术,术后称量新生胎仔体重及胎盘、脑、心、肝、肺、肾等重要脏器重量,对比各组间新生胎仔的预后的不同,并对照研究阻断血供10、20、30及40 min对胎仔的不同影响。结果妊娠晚期阻断孕鼠卵巢动脉20min可成功构建胎儿生长受限模型,这种方法与阻断动脉血流30或40 min相比,手术时间短,技术要求不高,胎仔死亡率与对照组差异无显著性(P>0.05)。各实验组较对照组新生胎仔体重及胎盘、各重要脏器重量均明显降低(P<0.05)。结论通过阻断卵巢动脉从而阻断子宫动脉血流,成功建立缺血缺氧性FGR孕鼠模型。该模型重复性好,操作简便,并可成功设立同体对照,为进行FGR相关的产科理论研究提供了一个有利的技术平台。     

一种改良的二甲基亚硝胺肝纤维化模型诱导方法及其病理特点

目的探讨旨在降低死亡率的二甲基亚硝胺(DMN)肝纤维化改良造模方法及其病理特点。方法大鼠分为常规方法造模组(常规组)与改良方法造模组(改良组),每组再分为模型组与正常对照组,均设染毒后4周和8周共2个时间观察点。常规组造模以DMN10μL/kg大鼠体重的剂量,腹腔注射,每周连续3d,连续4周,共12次;改良组同上剂量的DMN腹腔注射,每2d一次,连续4周,共14次。观察大鼠体重、肝体比与脾体比,试剂盒测定血清肝功能,HE染色与天狼猩红染色分别观察肝组织炎症与胶原沉积,盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸含量。结果2种造模方法均在造模4周时形成典型的肝纤维化,模型大鼠的体重、肝体比、脾体比、血清肝功能等均有相应的变化趋势。与常规组比较,改良组模型大鼠造模8周后死亡率显著降低,肝细胞炎症坏死稍轻,而肝窦毛细血管化明显。结论隔日1次腹腔注射较之连续3d腹腔注射DMN是一种较为稳定的肝纤维化改良造模方法,具有肝窦毛细血管化与小叶内纤维化的肝纤维化病理特征。     

牛磺酸对乳鼠心肌细胞内钙浓度的影响

研究低氧、复氧对乳鼠心肌细胞内钙离子浓度的影响,以及牛磺酸在模拟心肌缺血/再灌注(I/R)过程中对细胞内钙的调节作用。采用SD大鼠乳鼠进行心肌细胞培养,建立模拟I/R模型。以Fluo-4/AM荧光指示剂负载,应用激光共聚焦显微镜技术(confocal laser scanning microscope,CLSM)检测心肌细胞钙离子浓度的变化。对照组心肌细胞内钙离子荧光强度(23.71±2.37U)较低;低氧180 min后复氧即刻,钙离子荧光强度开始增加(57.52±8.31U),复氧180 min后钙离子荧光强度(71.13±4.74U)显著增高(P<0.01vs对照组)。而牛磺酸组细胞内钙离子荧光强度较模拟I/R组显著降低[(42.42±4.17U)vs(71.13±4.74U),P<0.01]。心肌细胞缺血/缺氧导致Ca2+超载;模拟I/R Ca2+超载加剧,而牛磺酸有明显减轻心肌细胞模拟I/R时Ca2+超载的作用。     

高原低氧胁迫对小鼠肝脏功能及基因表达的影响

低氧作为青藏高原最为特殊的环境因素之一,对高原动物的适应进化产生了深刻的影响。持续的低氧暴露会损伤肝脏功能,引起动物机体代谢紊乱,但连续低氧处理对子代肝脏的影响仍缺乏相关研究。本研究将成年小鼠转移至高原低氧环境 (海拔3 220 m) 饲养并繁殖,以常氧条件下饲养小鼠为对照,统计低氧处理小鼠 (低氧第0代) 及其子代 (低氧第1 ~ 5代) 生长数据,发现长期低氧暴露导致小鼠肝脏比重增加,肝细胞肿胀,肝索间红细胞浸润,并且子一代小鼠肝小叶出现脂肪变性。血液生化指标显示,相比于对照组 (常氧第0代),低氧第0代和低氧第1代的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平显著上升 (P < 0.05);血清白蛋白、球蛋白、总胆红素和总胆固醇水平在低氧第0代中下降,低氧第1代中上升 (P < 0.05)。空腹注射葡萄糖和胰岛素后低氧组小鼠的葡萄糖耐受能力和胰岛素敏感性显著减弱 (P < 0.05)。常氧第0代、低氧第0代及低氧第1代肝脏RNA-seq分析发现,低氧第0代和低氧第1代共有的459个差异基因显著富集在MAPK、细胞凋亡、脂质代谢和内质网等信号通路。本研究发现低氧胁迫对子代小鼠肝脏具有重要影响,此结果对肝脏低氧生理和高原肝脏疾病的研究具有重要的借鉴意义。