应用纳米金探针检测HSV-2的目视化基因芯片

本实验建立了一种应用金标链霉亲和素探针的目视化高灵敏度检测单纯疱疹病毒2型(Herpes Simplex Virus-2, HSV-2)的基因芯片.该芯片以HSV-2 DNA 聚合酶的高保守区为靶序列,设计HSV-2特异性引物和探针,通过PCR反应使扩增产物标记上生物素;氨基修饰的探针固定在活化的玻片上,与生物素标记的扩增产物杂交;利用生物素与链酶亲和素高亲合力的特性,加入纳米金标记的链酶亲和素后形成生物素-链酶亲和素-纳米金生物反应放大系统;银染反应后,达到目视化检测HSV-2效果.该HSV-2检测基因芯片能目视化检测出100fmol/L的HSV-2扩增产物,具有灵敏度高,低成本的特点,通过临床标本验证表明该芯片具有较高的准确性.     

长白山高山苔原带蛾类物种组成及其时间动态

长白山高山苔原带环境条件恶劣，通过对高山苔原带蛾类研究，揭示蛾类物种组成以及时间变化，可为研究蛾类对苔原极端生境的适应能力，以及蛾类在维持苔原带生态平衡中的作用提供依据。2005-2007年和2019年，每年的6、7、8月，在长白山高山苔原带利用灯诱采集蛾类标本，分析蛾类的物种组成以及时间动态。共采集蛾类1585头，隶属于13科126种，夜蛾科（Noctuidae）为优势类群，绿组夜蛾（Anaplectoides prasina）和一色兜夜蛾（Cosmia unicolor）为优势种，稀有种较多。蛾类的种-多度分布接近生态位优先假说。7月份蛾类的物种数、个体数最多，丰富度指数、多样性指数都最高，但均匀度指数却最低。不同种类对时间的反应表现出一定的差异，黄绿组夜蛾（Anaplectoides virens）对8月，厉切夜蛾（Euxoa lidia）对6月的适应力相对较强。各物种的顺序日期存在一定的差异性，只有10种蛾类在3个月份都被采集到。研究表明，长白山高山苔原带蛾类的多样性较低，成虫活跃期较短；不同类群的蛾类在苔原环境中显示出差异化的适应性，夜蛾科的适应能力超过其它类群，尺蛾科（Geometridae）的适应性相对较低，蛾类对时间的变化反应比较敏感。     

利用CRISPR/Cas9系统和TALEN技术干预XIST基因的表达

XIST是维持雌性哺乳动物X染色体稳定失活的重要长链非编码基因。X染色体失活异常导致X连锁基因的过量表达从而参与了癌症等疾病的发生。干预XIST的表达在XIST的生物学功能和相关疾病发生的研究中是必不可少的。该研究利用CRISPR/Cas9系统和TALEN技术在293T细胞中对已知的XIST核心启动子进行编辑,建立了通过酶切、测序等鉴定突变效率的方法,并且结合极限稀释法、片段分析和TA克隆测序得到基因型确定的XIST低表达的单克隆细胞系。结果显示,CRISPR/Cas9和TALEN对XIST核心启动子的突变可以有效地抑制XIST的表达。该研究表明,针对XIST核心启动子的基因组编辑可以干预XIST的表达,这为长链非编码RNA基因的敲低提供了新的思路。     

不同环境类型对华北落叶松分布的潜在影响

植物分布-环境因子之间的关系是生态学、生物地理学研究中一个核心问题。采用最大熵物种分布模型,选取气候、土壤和地形3类环境类型中33个因子,对气候、气候-土壤、气候-地形、气候-土壤-地形4种环境组合对华北落叶松在河北省、山西省和内蒙古自治区的分布预测进行建模和检验。利用ArcGIS空间统计,划分华北落叶松分布适宜区,并制作分布适宜性等级图。结果表明,不同环境类型组合对华北落叶松分布影响的训练集和检验集的AUC值在0.965-0.983之间,均达到极准确的精度水平。在影响华北落叶松分布的主导因子上,气候、气候-土壤两种环境类型组合均为最热月的最高温度、温度的年较差和季节性温度变异,累计贡献率均达到74%以上,而气候-地形、气候-土壤-地形两种环境类型组合中海拔和坡度的影响最大,分别为48.8%和51.8%。在影响华北落叶松适生区（中、高、极高适宜区）面积上,气候、气候-地形两种环境类型组合差异不大,分别为102583km²和100698 km²,而气候-土壤、气候-土壤-地形两种环境类型组合影响下的华北落叶松适生区面积出现显著下降分别为57134 km²和66754 km²。最大熵模型能够很好的预测华北落叶松分布,地形因子能明显改变单一气候因子对华北落叶松分布的预测结果,虽然土壤因子对落叶松分布格局的影响不大,但在适宜性、尤其是中等以上适宜区分布上,其影响作用显著。以上结论可为华北地区的生态修复和落叶松可持续经营提供依据。     

自然感染途径建立肺炎链球菌感染性肺炎小鼠模型

目的探索自然感染途径制备肺炎链球菌感染性肺炎小鼠模型的方法,为肺炎链球菌性肺炎的相关研究提供实验基础。方法肺炎链球菌标准菌株(CMCC 31203)经血平板培养18 h后配成2麦氏浊度。小鼠浅麻醉状态下,破损鼻黏膜,滴注一定量肺炎链球菌菌液。于3、7、14和21 d分别处死小鼠,取肺脏进行组织病理学观察,确定肺炎小鼠模型制备的最佳方式。结果鼻黏膜破损组小鼠3 d时肺泡间隔内毛细血管扩张,肺泡腔内以红细胞和纤维素渗出为主;7 d时病变以纤维素和中性粒细胞浸润为主;14 d时肺泡腔内渗出减少,炎症开始减轻;21 d时肺脏外观趋于正常,肺泡腔内渗出物质基本溶解吸收。结论以3×107CFU的肺炎链球菌菌液通过破损的鼻黏膜感染7 d时可以制备出比较典型、稳定的肺炎小鼠模型。     

NH4+对L-色氨酸发酵的影响

目的:探究NH₄⁺浓度对大肠杆菌E.coli TRTH发酵生产L-色氨酸的影响。方法:通过外源添加试验,利用30 L发酵罐进行分批补料发酵试验,考察E. coli TRTH发酵生产L-色氨酸过程中生物量、L-色氨酸产量、有机酸含量、耗糖速率、发酵液中NH₄⁺浓度及质粒稳定性变化。建立了大肠杆菌合成L-色氨酸的代谢流平衡模型,应用 MATLAB 软件计算出E. coli TRTH发酵中后期代谢网络的代谢流分布。结果:发酵结果显示,利用NaOH和氨水混合补料,控制NH₄⁺浓度在120 mmol/L以下,菌体能够以较长时间和较高比生长速率保持对数生长,最终菌体生物量和L-色氨酸产量分别提高了12.16%和19.80%。随着NH₄⁺浓度的增加,发酵液中丙酮酸、乳酸及乙酸浓度均略有增加,细胞质粒稳定性下降。控制NH₄⁺浓度在120 mmol/L以下,E. coli TRTH发酵生产L-色氨酸的代谢流量分析结果表明,EMP途径的代谢流量降低7.31%,PP途径的代谢流量增加7.14%,TCA循环的代谢流量降低22.04%。结论:高浓度的NH₄⁺导致菌体生长提前结束,耗糖速率降低,产酸受阻,控制NH₄⁺浓度在120 mmol/L以下,解除了NH₄⁺对菌体生长和产物生成的抑制,使得菌体生物量和L-色氨酸产量大幅提高,实现了高密度发酵培养的目的。     

主动脉弓缩窄诱导大鼠心肌肥大Raf/MEK/ERK通路的变化

目的:通过观察心肌肥大大鼠加速纤维肉瘤/丝裂素活化蛋白激酶激酶/胞外信号调节蛋白激酶(Raf/MEK/ERK)通路关键因子的基因和蛋白表达及蛋白磷酸化修饰水平上的变化,了解Raf/MEK/ERK通路在心肌肥大调控中的作用。方法: 20只SD大鼠随机分为假手术组和模型组,通过主动脉弓缩窄(TAC)法建立心肌肥大模型,12周后颌下静脉取血分离血清,检测氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)含量,之后进行超声心动图测定和麻醉下的血流动力学测定,收集心肌标本,观察心肌组织的病理学改变,检测心肌组织Raf/MEK/ERK通路的关键因子基因、蛋白表达水平及蛋白磷酸化水平的变化。结果:与假手术组比较,TAC模型组大鼠超声心动图的左室舒张末期室间隔厚度(IVSd)、左室收缩末期室间隔厚度(IVSs)、左室后壁舒张末期厚度(LVPWd)、左室后壁收缩末期厚度(LVPWs)显著增厚(P＜0.05,P＜0.01),左室收缩末期内径(LVIDs)显著减小(P＜0.01),左心室质量(LV Mass)、左心系数LW(LV Mass/Weight)比值显著增加(P＜0.05,P＜0.01);大鼠心率(HR)、左心室最大收缩速率(+dp/dtmax)、左心室最大舒张速率(-dp/dtmax) 均显著降低(P＜0.01),血清中NT-pro BNP含量显著增加(P＜ 0.01);心肌细胞排列杂乱,心肌细胞肥大、胞质明显增多,炎症细胞浸润,出现大量胶原纤维沉积,大面积心肌细胞呈现蓝色;大鼠心肌组织中c-Raf在Ser259和Ser338上的磷酸化蛋白phospho-c-Raf (Ser259)和phospho-c-Raf (Ser338) 表达水平显著升高(P＜0.01),其下游MEK1/2、ERK1/2的磷酸化蛋白phospho-MEK1/2(Ser217/Ser221)和phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)表达水平也显著增高(P＜0.01)。结论: Raf/MEK/ERK通路在心肌肥大中的调控作用,可能通过激活关键因子c-Raf、MEK1、MEK2、ERK1和ERK2特异性位点的磷酸化实现的。     

光周期和高脂食物对高山姬鼠消化道形态的影响

为探讨光周期和高脂食物对栖息于横断山地区高山姬鼠Apodemus chevrieri消化道形态的影响,将成年雌性高山姬鼠分别驯化于长光照低脂、高脂食物和短光照低脂、高脂食物条件下,7周后测定动物的体重、总消化道、胃、小肠、大肠、盲肠的长度及其含内容物重、去内容物重、干重。结果表明:短光低脂组总消化道长显著大于其他组,短光组的小肠长度显著大于长光组。总消化道含内容物重、去内容物重,胃去内容物重、干重以及大肠和盲肠的各项指标均是低脂食物组显著大于高脂食物组。而小肠干重则是高脂食物组显著大于低脂食物组。以上结果表明,高山姬鼠在光周期和食物质量不同的条件下,可能通过调节消化道形态来维持正常的能量代谢和生理机能。高山姬鼠的消化道在不同光周期和食物质量条件下表现出的变化模式,可能与其光照和食物资源季节性波动的野外生存环境有关,从一方面反映了该物种在不同环境下的生存机制和适应对策。     

稳定表达hSOD1^G93A基因的肌萎缩侧索硬化体外细胞培养模型的建立与鉴定

目的建立并鉴定稳定表达G93A型突变人超氧化物歧化酶（hSOD1^G93A）基因的肌萎缩侧索硬化体外细胞培养模型。方法利用活化的树突状聚合物将空质粒、hSOD1^WT、hSOD1^G93A基因转染入VSC4.1细胞内,G418抗性筛选,从而建立稳定的肌萎缩侧索硬化体外细胞模型。用免疫荧光技术检测VSC4.1细胞系运动神经元标志物。蛋白印迹实验鉴定hSOD1^WT蛋白、hSOD1^G93A蛋白的表达。MTT法检测细胞模型生长曲线。结果VSC4.1细胞分化前表达ClassⅢβ-Tubulin、MNR2,分化后表达ClassⅢβ-Tubulin、MNR2、NF200、MAP2等运动神经元标志物。VSC4.1-hSOD1^WT、VSC4.1-hSOD1^G93A细胞均过表达人来源的SOD1,而VSC4.1-mock则不表达。与VSC4.1-mock、VSC4.1-hSOD1^WT相比,VSC4.1-hSOD1^G93A生长缓慢,在48、72 h细胞活力均低于VSC4.1-mock（P=0.031,P=0.000）、VSC4.1-hSOD1^WT（P=0.001,P=0.000）,其余时间点无明显差异（P〉0.05）。结论成功建立稳定表达hSOD1^WT、hSOD1^G93A基因的VSC4.1细胞系,为进一步研究肌萎缩侧索硬化的发病与治疗奠定了良好的基础。