膜联蛋白AnxB1的同源模建及降低免疫原性研究

膜联蛋白AnxB1是我们发现的一个新的膜联蛋白亚家族成员, 具较强的抗凝血活性和血栓亲和性. 为更深入研究AnxB1的结构与功能, 首先利用同源建模的方法预测AnxB1的三维结构, 发现AnxB1具有四个内部同源结构域, 其中1, 2, 4结构域的Cα主链叠合非常一致. 以此为基础, 构建四个序列缺失突变体M1, M2, M3, M4, 并在大肠杆菌GST融合表达系统表达, 其中的两个突变体GST-M3, GST-M4不仅保留了较强的抗凝血活性, 而且免疫原性大大降低, 分子量也分别减少到27和34 kD. 为进一步构建高效、低免疫原性的靶向性溶栓药物奠定了基础.     

HeLa细胞表达分泌重组eGFP—DPF-1在卵母细胞上的定位

将兔输卵管蛋白(DPF-1)基因连结于增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因5′端,构建了真核表达重组质粒(pEGFP-N1／DPF-1),转染HeLa细胞,获得稳定表达分泌融合蛋白eGFP—DPF-1的HeLa细胞株。该融合蛋白呈现的分子量达120KD,提示经翻译后修饰。取兔卵母细胞-卵丘细胞复合物(COC)、去除卵丘细胞后的卵母细胞或输卵管内的卵母细胞,与该株细胞共培养或培养于该株细胞条件培液中,观察兔输卵管蛋白在兔卵母细胞上的分布。结果显示DPF-1大量结合于卵母细胞透明带,先结合于透明带内层,然后维持在内层多外层少的分布状态上;在卵母细胞质膜表面则呈点状均匀分布。DPF-1在卵母细胞上的分布不受其周围颗粒细胞的阻碍,且颗粒细胞上未见有DPF-1结合的痕迹。本实验首次证实体外真核细胞表达分泌的输卵管蛋白能与卵母细胞结合,并借助绿色荧光蛋白作为示踪信号体外直接观察到该表达产物在卵母细胞上的动态分布,为进一步深入分析输卵管蛋白的功能提供了线索,也为研究输卵管内其他蛋白在配子／早胚上定位提供了可行的办法。     

TGF-β/Smads在肺癌中的表达研究

转化生长因子TGF-β／Smads是细胞增殖的抑制因子。它可以促进细胞外基质的增生和原发性肿瘤的转移。选择20例肺癌组织标本及8种不同转移能力的肺癌细胞系,通过荧光免疫组织化学染色法进行RⅡ和Smsds蛋白定位及表达分析。初步探讨了TGF-β／Smads信号传导通路与肺癌发生和转移的关系。     

磷酸钙纳米介导自杀基因载体的构建及其应用研究

构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达载体和分别由CEA启动子和巨细胞病毒(CMV)增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CEAyCDglyTK、PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK表达栽体.以磷酸钙纳米为载体分别转染CEA阳性的人结肠癌细胞株LOVO细胞和CEA阴性的HeLa细胞,Lovo细胞在感染以上3种质粒表达栽体后均有yCDglyTK mRNA表达,且对5-FC的敏感性明显增强:HeLa细胞在纳米PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK复合物感染后有yCDglyTK mRNA表达,对5-FC的敏感性增强,而在另外两种复合物感染后则没有yCDglyTK mRNA表达,5-Fc对其亦无杀伤作用,结果表明靶向性基因治疗栽体能使融合自杀基因在CEA阳性细胞中专一性表达,达到靶向治疗肿瘤的目的.     

伴花生球蛋白cDNA克隆及其在花生发育种子中的表达

利用伴花生球蛋白多克隆抗体,免疫筛选花生品种汕油523成熟子叶中期cDNA文库得到6个阳性克隆.经过DNA序列测定和同源性分析确定为2组(Ahyα和Ahyβ) ,2组序列之间的同源性为97%.Ahyβ与花生过敏原Ara h1 p17以及Ahyα与花生过敏原Ara h1p41b的核苷酸相同性达到99%以上.以Ahy-βcDNA为探针的Northern blot分析结果表明,伴花生球蛋白基因在发育的花生种子中大量表达,而在幼苗的叶片中不表达.对成熟中期花生子叶表达序列标签(EST)分析,获得了包括5种花生球蛋白、2种伴花生球蛋白、6种conglutin蛋白的EST共70条,占总转录本的17%.     

水稻小G蛋白OsPra2基因的克隆及功能分析

利用micro array 技术对水稻幼苗在营养胁迫条件下根部基因表达的研究中发现: 一个与豌豆Pra2(小G蛋白)基因有同源性的基因的RNA水平在营养胁迫后再补充营养时, 表达量下降。用RT-PCR和PCR方法分别获得该基因的cDNA克隆—OsPra2和该基因翻译起始位点上游1 kb的启动子序列。OsPra2基因编码的蛋白质具有结合GTP/GDP的4个保守结构域和构成小G蛋白Rab家族的特有的结构域。该基因cDNA与GST蛋白基因融合表达载体在洋葱表皮细胞中的瞬间表达结果显示该蛋白定位在在细胞膜和细胞核上, OsPra2基因启动子与GUS报告基因融合表达转基因水稻显示该基因启动子驱动GUS在胚芽鞘和根中表达, 35S启动子驱动OsPra2基因过表达转基因水稻与野生水稻株型相比明显矮化, 类似BR缺陷型植物株型。本实验还对OsPra2和P450蛋白的相互作用及在BR代谢途径中的可能作用进行了分析。     

水稻OsPLD3和OsPLD4基因及其启动子

磷脂酶D(Phospholipase D, PLD)是在植物组织中广泛存在的一类磷脂酶, 可催化磷脂如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)水解产生磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和一个自由的头部基团如胆碱(choline)。在植物体内PLD家族往往包括多个成员。利用反向遗传学技术对水稻磷脂酶D家族(OsPLD)中的两个成员OsPLD3和OsPLD4基因及其启动子的研究显示: OsPLD3和OsPLD4的启动子在花器官的不同部位中驱动报告基因不同程度地表达, 二者都受损伤和茉莉酸甲酯诱导, 但是对诱导因子反应的时空模式不同。利用转基因技术在水稻中过量表达OsPLD3和OsPLD4基因或是干扰OsPLD3和OsPLD4基因表达都不能引起可见的水稻表型的变化, 说明OsPLD家族不同成员可能有功能上的重复。     

植物DNA条形码研究进展

DNA条形码(DNA barcoding)已成为近5年来国际上生物多样性研究的热点,即通过使用短的标准DNA片段,对物种进行快速、准确的识别和鉴定.该技术在动物研究中已得到广泛的应用,所采用的标准片段是线粒体COI基因中约650 bp长的一段.然而在植物中DNA条形码的研究进展相对缓慢,目前尚处于对所提议的各片段比较和评价阶段,还未获得一致的标准片段.由于植物中线粒体基因组进化速率较慢,因此条形码片段主要在叶绿体基因组上进行选择,被提议的编码基因片段主要有rpoB,rpoCI,matK,rbcL,UPA,非编码区片段有tmH-psbA,atpF-atpH,psbK-psbI,此外还有核基因ITS.已有的研究表明以上任何一个单片段都不足以区分所有植物物种,因而不同的研究组相继提出了不同的片段组合方案,目前被广泛讨论的组合主要有5种.本文综述了DNA条形码序列的优点、标准、工作流程、分析方法和存在的争议,重点论述了植物条形码研究中被提议的各序列片段和组合的研究现状.     

磷饥饿时番茄幼苗根系质膜H+-ATP酶活性 的变化与磷吸收的关系

磷饥饿提高了番茄幼苗质膜H     

HPLC法分析不同年限及不同部位掌叶大黄9种成分的积累特征

为研究不同年限及部位掌叶大黄9种成分含量及其变化特征。利用HPLC法进行分析,色谱柱为武本C18 (5μm,4.6 mm×250 mm),流动相为甲醇-磷酸水(0.2%),检测波长260 nm,柱温30℃,体积流量1.0 mL/min,进样量10μL。线性范围良好(R^2>0.995),精密度、稳定性、重复性RSD均小于2%,加样回收率97.30%~108.20%。含量分析表明:同一部位,随着年限增加,除根中没食子酸、根茎中大黄素、叶片中大黄酚的含量无变化外,其他8成分的含量均随年限增加而增加或者第4年增加、第5年无显著变化。同一年限,大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量次序为根>根茎>叶片;3年生芦荟大黄素,4年生没食子酸、番泻苷B叶片中含量与根中大致相等且高于根茎;5年生大黄素-8-O-葡萄糖苷的含量次序为叶片>根茎>根,根与根茎中没食子酸、大黄酚的含量相当且高于叶片。本实验成功建立简便快捷、重现性好的HPLC分析方法,明确了不同年限及部位掌叶大黄9种成分积累特征,为大黄质量评价和药材高效生产提供理论依据。