产胶原酶的蜡样芽胞杆菌发酵条件优化及酶的分离纯化

【目的】优化蜡样芽胞杆菌R75E菌株产胶原酶的条件,并通过蛋白分离纯化技术获得高纯度胶原酶。【方法】利用单因素及正交试验优化蜡样芽胞杆菌R75E产胶原酶的发酵条件及发酵培养基,将发酵液离心除菌后得到粗酶液,对其依次通过硫酸铵分级沉淀、Butyl FF疏水层析及SuperdexTM 200凝胶过滤层析等方法对目标胶原酶进行分离纯化,利用SDS-PAGE电泳检测其纯度。【结果】优化后发酵条件为培养温度41°C、接种量6%、培养时间36 h,优化后发酵培养基为葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、起始p H 7.0,粗酶液酶活力较优化前提高了2.9倍;将该粗酶液经过一系列纯化后得到纯度超过90%的胶原酶产物,其纯化倍数和回收率分别为18.4和1.1%。【结论】获得蜡样芽胞杆菌R75E的最佳产酶条件,并对胶原酶分离纯化的方法进行了探索,为微生物胶原酶的开发应用奠定基础。     

建立以TK基因为标记将外源基因导人臭曲霉(Aspergillus foetidus)的选择系统及外源基因的表达

本文报道建立以胸腺嘧啶核苷激酶(TK)为标记,利用痘苗病毒TK基因为旁侧序列的外源基因载体,通过体内同源重组的原理将外源基因导入臭曲霉菌,并用5-溴脱氧尿嘧啶核膏(BudR)进行转化株选择的新系统,对黑曲霉菌TK+株的挑选、转化及选择条件等进行了研究。用这一系统,成功地将臭曲霉菌自身分离到的启动基因H8驱动下的乙肝表面抗原(HB8sAg)基因导入臭曲霉菌。Southern blot和多次孢子传代证实,HBsAg基因已与宿主的DNA稳定整合：在发酵上清液中,ELIAS检测HBsAg为阳性(P/N值在20左右),wwstern blot有特异的带存在,免疫电镜观察发现,在发酵液中存在有与人血清中HBssAg颗粒大小、形态相似的22nm的颗粒。这些结果表明,HBAg基因在臭曲霉菌中已获表达。本文建立的基因导入和选择系统可广泛应用于各种外源基因在臭曲霉菌中表达的研究。     

感染大麦黄花叶病毒(BaYMV)的大麦细胞质内含体及细胞器病变的研究

超薄切片电镜观察表明,在感染大麦黄花叶病毒(BaYMV)的大麦(品种“早熟3号”)叶肉细胞中,液泡周围偶而可看到病毒颗粒束,在发病后期黄化或坏死的叶肉细胞中,可见到散布的病毒颗粒。在所有表现症状的病叶叶肉细胞,表皮细胞和木质部薄壁细胞中均可观察到风轮体、束状体、板状集结体以及膜状体等细胞质内含体,未见 卷简体和细胞核内含体。感病初期细胞中,细胞质丰富,核糖体数量增加,内质网肥大,随着病毒症状发喂,叶绿体、线粒体等细胞器逐渐肿大,外膜破裂直至解体。     

生物素标记DX_(13)探针及一例甲型血友病家系分析

 以Bio-ll-dUTP替代dTTP经二步法缺口平移标记DNA片段制得生物素DX_(13)探针。其碱性磷酸酶ABC体系显色灵敏度为100fg(约5×10~(-18)mol);与5μg染色体DNA进行Southern印迹杂交,可得清晰的单拷贝杂交区带。以此探针对一血友病家系做RFLP分析,确定两成员为甲型血友病基因携带者。与32P探针对比,两种探针的杂交和分析结果完全一致。表明高标记的生物素探针可应用于单拷贝基因分析和基因诊断。     

固氮螺菌的血清学研究——Ⅱ.固氮螺菌五个血清型的抗原定性分析

本文采用琼脂双扩散、对流电泳及免疫电泳等技术对固氮螺菌五个血清型的代表菌株进行抗原定性分析。试验结果说明:五个不同的血清型的可溶性抗原具有共同的抗原成份,但各自存在着特异性抗原。     

露水草中20—羟基蜕皮甾酮的动态变化

采用ＨＰＬＣ技术对云南产鸭跖草科分属于３个族１０个属的１３种植物中的２０－羟基蜕皮甾酮进行分析,结果表明２０－羟基蜕皮甾酮广泛存在于已分析的该科植物中,但含量除露水草外均甚微,不具有化学分类学的意义。２０－羟基蜕皮甾酮在不同产地和不同生长季节的露水草中的含量变化,则与蝶类昆虫的活动显示有一定的相关性,从而提示２０－羟基蜕皮甾酮有可能是露水草与蝶类昆虫协同进化过程的具有化学生态学意义的代谢产物。     

高分子量RGD-蛛丝蛋白重组体的构建、高密度发酵及纯化

蜘蛛丝是自然界综合性能优良的天然蛋白质纤维之一,因其具有良好的生物相容性和可降解性在生物医学领域具有潜在的应用前景。在本室已经构建的RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因16多聚体基础上,通过首尾相连、倍加等方法进一步多聚化,得到RGD-蜘蛛拖丝蛋白基因32和64多聚体,分别将这两种多聚体与原核高效表达载体pET-30a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,得到的32多聚体表达重组子命名为pNSR32,64多聚体表达重组子命名为pNSR64。通过酶切、琼脂糖电泳鉴定及对目的片段的测序均与理论值相符。将32和64多聚体基因序列注册GenBank,序列号分别为DQ469929和DQ837297。重组体pNSR32和pNSR64经IPTG诱导表达,SDS-PAGE图谱显示表达产物分子量分别为102kD和196.6kD,与天然蛛丝蛋白分子量接近并与理论值相吻合。高分子量的蛛丝蛋白在原核生物成功实现高效表达,在国内外尚未见报道。在此基础上对pNSR32工程菌进行高密度发酵,建立了简单高效的目的蛋白纯化工艺。     

氮肥水平对不同基因型水稻氮素利用率、产量和品质的影响

以不同基因型的水稻品种日本晴、N70、N178和OM052为供试品种,氮肥采用尿素,按基肥(70%)和蘖肥(30%)两次施用,设置3个施氮水平(N用量设0、120、270 kg·hm^-2)的田间小区试验,研究氮素水平对水稻产量、氮素利用效率和稻米品质的影响,以期为氮肥合理施用和氮高效水稻品种创制提供科学依据.结果表明:施氮能增加水稻品种产量的原因是提高了有效穗数和每穗实粒数;与对照(0 kg·hm^-2)相比,当施氮量为120和270 kg·hm^-2时,OM052籽粒产量在4个品种中增幅最大,分别为41.1%和76.8%;品种产量增幅不同是由于氮素利用效率的差异,在120、270 kg·hm^-2氮处理下,4个供试品种中,日本晴籽粒产量和氮素农学利用率(40.90 g·g^-1、18.56 g·g^-1)都最低,为氮低效品种,OM052籽粒产量和氮素农学利用率(145.9 g·g^-1、81.24 g·g^-1)都最高,为氮高效品种.施N能够增加各品种的直链淀粉和蛋白质含量,使胶稠度变长,降低垩白率、垩白度和碱消值;随施氮量增加,热浆黏度、峰值黏度、回复值和崩解值递减,而消碱值递增.相关性分析表明,低N水平下,供试品种产量及产量构成因子与外观品质、蒸煮食味的相关性更显著.综上,OM052是一个籽粒产量和氮素利用效率“双高”基因型品种,合理施用氮肥可以显著增加水稻的有效穗数和每穗粒数,改善稻米籽粒品质,实现高产和优质的协同.