寡氧单胞菌中CRISPR位点的分析

对寡氧单胞菌基因组中的CRISPR位点进行生物信息学分析。CRISPRdb数据库中公布的和NCBI上下载的共26株寡氧单胞菌的基因组序列,分析其CRISPR位点的分布情况、重复序列、间隔序列以及间隔序列和噬菌体序列数量之间的关系。共发现15个确定的CRISPR结构和132个可疑的CRISPR,不同菌株CRISPR结构中的重复序列具有较强的保守性。间隔序列的靶向基因主要来自细菌的基因组,说明寡氧单胞菌CRISPR的的进化与其他细菌基因有关。此外,间隔序列与前噬菌体数量之间的负相关关系,说明CRISPR能阻止噬菌体的入侵。寡氧单胞菌CRISPR位点的分析为进一步研究耐药性及基因组稳定性奠定了基础。     

HSV-1感染对神经胶质瘤细胞神经生长因子及其受体表达的影响

神经生长因子(NGF)主要由神经胶质细胞产生,通过特异的靶细胞表面的神经生长因子受体介导产生生物学效应,与神经细胞的生长发育、分化和凋亡等密切相关。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)作为一种嗜神经病毒,易造成神经细胞、神经胶质细胞凋亡或死亡。本实验以U251人神经胶质瘤细胞为研究对象,观察HSV-1感染致U251细胞凋亡的过程中NGF及其受体的变化情况。结果发现U251细胞是HSV-1的容许细胞;HSV-1感染致U251细胞凋亡过程中,NGF及其低亲和力受体p75NTR出现表达强度随时间先增强后减弱的趋势,而高亲和受体Tr-kA持续低表达。推测HSV-1感染致神经细胞凋亡中可能调控了神经营养因子的表达。     

调控子fur影响霍乱弧菌生物膜的形成

目的:铁摄取调节蛋白Fur,其在细菌体内维持铁代谢稳态中担任着抑制剂和激活剂的双重角色,已有研究证实Fur还是霍乱孤菌的毒力调控子.研究证实生物膜的形成和游动性与霍乱弧菌的毒力相关,因此我们通过一系列表型实验分析Fur蛋白对霍乱弧菌生物膜形成影响,并预测依赖Fur与霍乱弧菌致病相关的基因,为后续研究做准备.方法:基于自杀质粒缺失霍乱弧菌的Fur基因,并构建相应回补株及蛋白表达株;通过表型实验,比较霍乱弧菌野生株和fur突变株在细菌运动能力、生物膜形成.结果:成功构建霍乱弧菌fur缺失株,回补株和蛋白表达株,His-Fur蛋白在上清液表达.表型实验表明fur突变株的菌株游动性降低,生物膜形成能力增强.结论;因此我们得出Fur可能与其它调控子一起,调控霍乱弧菌的表多糖,TCP和鞭毛蛋白的合成,从而抑制霍乱弧菌生物膜的合成.转录调控子Fur直接或间接调控一些与环境生存和致病相关的基因,对霍乱弧菌的传播、侵染、定殖等过程发挥作用奠定了基础.     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株单加氧酶基因的克隆与表达

构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株荧光素样单加氧酶基因表达克隆载体,并进行融合表达。PCR扩增出嗜麦芽寡养单胞菌D2菌株基因组DNA中包含单加氧酶基因约1300bp的核酸片段,将其克隆到T载体pMD-18中进行序列测定,所得序列申请并获得GenBank登记号(GQ122330)。DNA star软件分析发现该基因片段中含有一个996bp的完整开放读码框架(ORF),与GenBank中收录的S.maltophilia R551-3(CP001111/GenomeProject17107)和K279a(AM743169)的MO基因核酸序列同源性分别为90%和89%,氨基酸序列同源性分别为93%和90%。根据该ORF序列设计分别含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的表达克隆扩增引物,PCR扩增、双酶切后将产物亚克隆到pET32a载体中,经过双酶切验证,证实成功获得了表达重组载体pET32a/MO;将其转化宿主菌E.coli BL21,IPTG诱导后成功表达出54.2ku的MO融合蛋白,为该酶进一步的功能研究和开发奠定了基础。     

肠球菌CRISPR-Cas系统基因结构的分析及其与耐药基因的关系

CRISPR-Cas系统是一种细菌的适应性免疫系统,参与特异性防御不同类型的可移动遗传元件,如质粒、噬菌体、转座子等的入侵。旨在分析肠球菌（Enterococcus）基因组中该系统的基因结构,并探讨其与细菌耐药基因之间的关系。NCBI数据库中下载10种肠球菌的全基因组信息,利用软件对CRISPR-Cas系统的分布、cas1基因、重复序列、间隔序列等进行比对分析;查找耐药相关基因,分析其与CRISPR-Cas系统之间的关系。235株肠球菌中含完整CRISPR-cas系统的有35株（14.9%）,含确定CRISPR阵列196个和cas基因簇46个。肠球菌基因组中CRISPR系统主要为II-A型（80.4%）,其次是II-C型（15.2%）,cas1基因序列的系统发育分析结果与CRISPR-cas系统的分型基本一致。肠球菌CRISPR-Cas系统的分布在不同菌种之间差异较大;CRISPR-Cas系统可能阻碍肠球菌某些耐药基因的水平转移。     

HCMV IE86对ARPE-19细胞周期的影响

目的:构建真核表达质粒pEGFP-N3-IE2,瞬时转染ARPE-19细胞,探讨其时视网膜色素上皮细胞周期的影响.方法:采用PCR方法从质粒pIEP86AD169扩增出IE2片段,将其定向克隆于pEGFP-N3,构建真核表达质粒pEGFP-N3-IE2,酶切、测序鉴定,脂质体介导瞬时转染ARPE-19细胞,RT-PCR、免疫荧光法分析IE2基因在mRNA和蛋白水平的表达.流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化.结果:成功构建重组质粒pEGFP-N3-IE2,并在被转染细胞中检测到IE2基因的表达;瞬时转染后细胞周期表现为S期细胞比例显著增高.结论:成功构建pEGFP-N3-IE2真核表达质粒,重组质粒能在ARPE-19细胞中顺利表达IE2,IE2基因可以引起ARPE-19细胞的细胞周期S期阻滞.     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株2套Ⅱ型分泌系统

嗜麦芽寡养单胞菌D2株经前期研究发现有2套Ⅱ型分泌系统（T2SS）,根据嗜麦芽寡养单胞菌K279a、R551—3、JV3、D457的T2SS基因簇序列,以及D2株的部分测序结果设计引物,采用基因移步法逐一扩增2套T2SS基因序列,产物连接至T载体,经酶切鉴定后测序、拼接。发现有22个完整的开放多码框架（ORF）,比对分析后发现T2SSl的基因簇与同种属细菌相应基因簇序列同源性均在80％以上,对应氨基酸序列同源性均能达到97％以上,而T2SS2基因簇与K279a、R551—3对应基因序列和氨基酸序列的同源性均不及T2SS1高。2套T2SS的GspE、F、I基因同源性在50％以上,其他对应基因同源性在35％～68％之间不等,氨基酸序列同源性则为15％～61％。2套他ss与铜绿假单胞菌PA01的同源性高于不同科的小肠结肠炎耶尔森菌。T2SS的序列测定及同源性分析为进一步研究细菌蛋白分泌机制奠定基础。     

SARS冠状病毒S基因序列克隆的构建

构建SARS冠状病毒S基因序列克隆p-SARS-S,作为自行设计、建立的RT-PCR检测方法的阳性对照,并为该基因的表达奠定基础.设计合成了位于病毒基因21 504～22 136位的长633 bp的序列片断作为模板进行PCR扩增;将PCR产物与T-Easy载体连接,经过转化提取重组质粒DNA.对构建的阳性克隆进行PCR、酶切、测序鉴定.对经EcoRⅠ酶切鉴定为阳性的重组表达质粒测序,结果显示插入片段大小、方向、碱基匹配与预期一致.构建的阳性对照克隆p-SARS-S有助于建立严格的SARS病毒基因室内质控措施.     

汉滩病毒截短S基因重组梭菌载体构建及表达

目的：构建含汉滩病毒截短核蛋白基因的重组质粒,并在口服疫苗载体产气荚膜梭菌中表达。方法：以质粒pGEX-4T-2/SA为模板,PCR扩增汉坦病毒截短核蛋白（SA）基因片断,克隆入穿梭载体pJRC200,构建重组质粒pJRC200-SA,转化E.coliDH5α,酶切鉴定。将pJRC200-SA电穿孔转化产气荚膜梭菌,厌氧培养,促芽孢形成诱导蛋白表达。超声裂解产气荚膜梭菌芽孢,对裂解产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定。结果：酶切、测序表明,SA基因片段被正确插入pJRC200中,Western blotting分析显示SA蛋白成功表达,并能被肾综合征出血热患者阳性血清特异性识别。结论：汉坦病毒截短核蛋白重组克隆构建成功,并能在产气荚膜梭菌中成功表达,为口服疫苗研发奠定了基础。