嗜麦芽寡养单胞菌SMP蛋白的胞外可调控分泌及序列分析

为了观察和探讨嗜麦芽寡养单胞菌SMP蛋白胞外可调控分泌现象及其机制,将收集到的环境株菌D2株及9株临床株在含不同成分的培养基中培养,取培养液上清利用SDS-PAGE电泳观察SMP蛋白分泌情况;提取各菌株基因组DNA,PCR扩增其smp基因并进行克隆和序列测定;将获得的SMP氨基酸序列用Blastp、Megalign等进行分析,并构建系统发育树。结果显示,不同来源的嗜麦芽寡养单胞菌胞SMP蛋白分泌均存在可调控现象,酵母提取物可抑制该蛋白的分泌,而适宜浓度的麦芽糖则具有促进作用。序列对比及系统发育树分析显示,SMP的氨基酸序列具有种属的特异性,且临床株和环境株中存在一定的差异,临床株中该蛋白的氨基酸序列高度保守,而环境株则序列差异相对明显的,但不同来源的菌株SMP均含有保守的信号肽;提示该蛋白可能与其致病性相关,其胞外分泌的可调控机制值得进一步深入探究。     

基于主成分特征投影法建立利用16S rRNA基因序列进行物种分类方法的研究

提出一种有别于系统发育树的根据16S rRNA基因序列进行物种分类的新方法。首先将基因的碱基字母形式转换成数字形式,构建多维向量。然后根据主成分分析方法将该向量向数据分布最大方向投影,将原数据用几个“主成分”线性表出,而不丢失原数据的信息,采用主成分的显示功能作出三维主成分特征投影视图,达到分类的目的。在双歧杆菌和肠球菌的分类识别中得到较好的应用。     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株的构建及鉴定

为深入研究smp基因的功能,需构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株。首先,PCR扩增D2株smp基因上游、下游片段作为上下游同源臂,同时扩增获得氯霉素抗性(cat)基因,采用SOE-PCR方法将各片段连接,然后双酶切后克隆入自杀质粒pEX18Tc,构建获得重组自杀质粒pEX18Tc-Δsmp/cat,并转化入大肠埃希菌SM10λpir。通过接合将重组自杀质粒转入嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株,经同源重组以cat基因替换野生株的smp基因,链霉素和氯霉素双抗培养基筛选接合子,15%蔗糖选择培养基筛选smp基因缺失株。PCR、酶切和测序验证重组自杀质粒pEX18Tc-Δsmp/cat构建正确,缺失株的分泌蛋白经12%SDS-PAGE证实嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株失去表达SMP蛋白的能力。结果显示成功获得smp基因缺失的嗜麦芽寡养单胞菌D2株,为进一步研究其功能和胞外分泌途径奠定基础。     

1株高产蛋白酶嗜麦芽寡养单胞菌的分离鉴定及其酶学活性的研究

双齿围沙蚕消化道中分离1株高产蛋白酶菌株D2(CGMCC保藏号:1868),经形态学、生理学、16S rRNA基因序列测定及系统发育分析确定为嗜麦芽寡养单胞菌。Lowry法检测显示该菌株产酶能力为1104 U/mL,最佳产酶条件为pH 8.0、25℃培养48 h;酪蛋白酶图谱法和凝胶成像分析证实其蛋白酶分子量约为42 ku,在培养上清液中纯度大于97%;该酶对粗酶品比活性为301 U/mg,酶活性的最适pH值为9,是一种碱性蛋白酶;最适温度为60℃;在55℃以下及pH 6~10的环境中具有较好的稳定性。嗜麦芽寡养单胞菌D2株有望成为一种新的蛋白酶生产资源。     

寡氧单胞菌中CRISPR位点的分析

对寡氧单胞菌基因组中的CRISPR位点进行生物信息学分析。CRISPRdb数据库中公布的和NCBI上下载的共26株寡氧单胞菌的基因组序列,分析其CRISPR位点的分布情况、重复序列、间隔序列以及间隔序列和噬菌体序列数量之间的关系。共发现15个确定的CRISPR结构和132个可疑的CRISPR,不同菌株CRISPR结构中的重复序列具有较强的保守性。间隔序列的靶向基因主要来自细菌的基因组,说明寡氧单胞菌CRISPR的的进化与其他细菌基因有关。此外,间隔序列与前噬菌体数量之间的负相关关系,说明CRISPR能阻止噬菌体的入侵。寡氧单胞菌CRISPR位点的分析为进一步研究耐药性及基因组稳定性奠定了基础。     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株2套Ⅱ型分泌系统

嗜麦芽寡养单胞菌D2株经前期研究发现有2套Ⅱ型分泌系统（T2SS）,根据嗜麦芽寡养单胞菌K279a、R551—3、JV3、D457的T2SS基因簇序列,以及D2株的部分测序结果设计引物,采用基因移步法逐一扩增2套T2SS基因序列,产物连接至T载体,经酶切鉴定后测序、拼接。发现有22个完整的开放多码框架（ORF）,比对分析后发现T2SSl的基因簇与同种属细菌相应基因簇序列同源性均在80％以上,对应氨基酸序列同源性均能达到97％以上,而T2SS2基因簇与K279a、R551—3对应基因序列和氨基酸序列的同源性均不及T2SS1高。2套T2SS的GspE、F、I基因同源性在50％以上,其他对应基因同源性在35％～68％之间不等,氨基酸序列同源性则为15％～61％。2套他ss与铜绿假单胞菌PA01的同源性高于不同科的小肠结肠炎耶尔森菌。T2SS的序列测定及同源性分析为进一步研究细菌蛋白分泌机制奠定基础。