血小板来源的生长因子通过ERK/p38/PI3K促进人视网膜色素上皮细胞的增殖、迁移

目的:探讨血小板来源的生长因子(PDGF)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE)增殖和迁移的影响,并对参与其中的信号通路做初步研究.方法:体外培养的人视网膜色素上皮细胞与含有重组人血小板来源的生长因子的培养基(含有或不含2％(v/v)胎牛血清)共培养,用MTT法检测PDGF对RPE细胞增殖的影响,利用细胞爬片和免疫荧光技术检测PDGF对RPE细胞迁移等影响;另外分别向细胞培养物中添加PD98059,SB203580和PI3K等不同的信号通路分子抑制剂,判断参与PDGF激活的细胞活动相关的信号通路.结果:外源性PDGF能促进体外培养的人RPE的增殖和迁移.ERK1/2选择性抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002能显著的降低PDGF-BB诱导的人RPE细胞的增殖(P＜0.05),p38抑制剂SB203580没有明显的抑制作用.而对PDGF-BB诱导的RPE细胞的迁移,SB203580和LY294002有显著的抑制作用(P＜0.05),PD98059抑制作用不显著.结论:PDGF对RPE细胞的影响提示其在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发展中有重要的作用,其可能为PVR提供一种新的毒副作用小的治疗手段.     

小桐子JcLEA4基因克隆及表达和功能分析

LEA蛋白是一类跟抗逆性紧密相关的蛋白,在不同物种中都有大量发现。基于前期对小桐子叶片在干旱锻炼和干旱胁迫下的RNA-seq分析,本研究分离出一个LEA编码基因(XM_012232372.1),经序列分析可知该蛋白基因CDS序列全长为459 bp,编码蛋白由152个氨基酸组成。多重序列比对和进化分析显示该蛋白属于第四组典型亲水性LEA蛋白,暂命名为Jc LEA4。荧光定量PCR分析发现,幼苗叶片中Jc LEA4转录本的积累受到空气干旱胁迫和外源ABA处理的显著诱导。在酿酒酵母中异源表达分析显示,Jc LEA4的过表达提高了转基因酵母对PEG模拟干旱胁迫的存活率和生长速率,表现出增强的耐受性。本研究初步证实了Jc LEA4基因与抗旱性紧密相关,为以后小桐子的抗旱性遗传改良提供了良好的基因资源。     

Survivin、bFGF、VEGF在宫颈癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系研究

目的:研究存活素(Survivin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)在宫颈癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:选择2015年1月-2017年12月期间武汉大学人民医院收治的宫颈癌患者95例为宫颈癌组,宫颈上皮内瘤变患者70例为宫颈上皮内瘤变组,取同期在我院进行治疗的宫颈炎患者50例纳入对照组。采集三组患者的宫颈组织标本,采用免疫组化SP法对各组织标本中的Survivin、bFGF、VEGF的阳性率、表达水平进行检测,并分析Survivin、bFGF、VEGF与宫颈癌临床病理特征的关系以及各指标表达水平的相关性。结果:宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变组的Survivin、bFGF、VEGF的阳性表达率、表达水平均高于对照组,且宫颈癌组高于宫颈上皮内瘤变组(P0.05)。Survivin、bFGF、VEGF的表达与宫颈癌患者的年龄、病理类型、分化程度无关(P0.05),而与宫颈癌肿瘤的分期、淋巴结转移有关(P0.05)。Spearman相关性分析显示,Survivin、bFGF、VEGF三者间的表达水平两两呈正相关(P0.05)。结论:Survivin、bFGF、VEGF的表达水平与宫颈癌的发生、发展有密切关联,并且三种指标间呈明显的正相关性,可能对于宫颈癌肿瘤组织的浸润、转移、分期发挥协同作用。     

大肠杆菌CusS的生物信息学分析及对银离子胁迫的响应

【目的】解析大肠杆菌(Escherichia coli) K-12菌株同型二聚体内膜传感器组氨酸激酶(sensor histidine kinase, CusS)蛋白在细菌应答金属银离子胁迫中的调控机制,为该菌的防治提供重要科学依据。【方法】利用ProtParam、ProtScale、Protein-Sol、TMHMM、SignalP、LocTree3、NetNGlyc-1.0、NetPhosBac-3.0、SOPMA、I-TASSERF、STRING和MEGA分别预测CusS的理化性质、亲水性、可溶性、跨膜域、信号肽、亚细胞定位、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构、三级结构、蛋白互作的关系网络和蛋白在革兰阴性杆菌中的同源性。采用Red同源重组技术构建大肠杆菌ΔcusS,在不同培养基中连续监测ΔcusS的生长情况,观察该基因缺失后的细菌生长活性;通过最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)试验评价该缺失株对金属铜、银离子和临床常见抗生素的敏感性变化;运用RT-qPCR检测cusS缺失后其下游基因cusCFBA和cusR转录水平。【结果】CusS蛋白由480个氨基酸组成,相对分子质量为53 738.05,原子总数为7 624,等电点为6.02,具有稳定性,是一种亲水性、不溶性蛋白;含有跨膜域;不存在信号肽,定位于细胞内膜中;存在2个糖基化位点、24个丝氨酸磷酸化位点、14个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点;二级结构中α-螺旋占比55.42%,β-折叠占比11.67%,β-转角占比3.75%,无规则卷曲占比29.17%;cusS在埃希菌属和志贺菌属中的保守性高;菌落PCR和一代测序验证ΔcusS构建成功;连续检测生长曲线表明cusS缺失并不影响细菌的生长代谢,但CusS蛋白为大肠杆菌抵御金属银胁迫的关键基因。【结论】cusS作为一个关键基因,它的缺失并不影响大肠杆菌的生长活性,但会显著降低细菌抵御银离子胁迫的应答能力。缺失cusS将使下游基因cusCFBA和cusR的mRNA表达水平显著下降。对CusS蛋白进行生物信息学分析及表型初探,为深入了解CusS在大肠杆菌应答银离子胁迫的调控机制奠定了基础。     

不同土地利用方式下酚酸物质与土壤微生物群落的关系

酚酸物质是影响微生物生物量和群落结构的重要因子之一,研究酚酸物质在不同土地利用方式下的变化规律及其与微生物群落结构的关系,有助于更好地理解不同土地利用方式下微生物群落变化的作用机制。以山河屯林业局奋斗林场次生林(SF)、落叶松人工林(LP)、农田地(FL)和撂荒地(AL)为研究对象,测定不同土地利用方式下0—5 cm、5—10 cm和10—20 cm层的土壤总酚、复合态酚、水溶性酚和9种酚酸物质,并采用磷脂脂肪酸法(PLFA)测定这4种土地利用方式的土壤微生物群落。结果表明,各土层的落叶松人工林土壤总酚含量显著高于其他三种土地利用方式。在0—5 cm和5—10 cm土层中,落叶松人工林土壤水溶性酚含量最高,而在10—20 cm土层中,则是次生林显著高于其余三种土地利用方式(P0.05)。在0—5 cm土层中,次生林土壤的总PLFA、真菌含量比农田地和撂荒地分别高14.61%、80.91%和55.63%、156.55%,同时,次生林的土壤真菌∶细菌(F∶B)显著高于落叶松人工林、农田地和撂荒地(P0.05)。0—5 cm层和5—10 cm层的土壤总酚与微生物群落(细菌、真菌)分别呈正相关和负相关关系,而在10—20 cm层,三种土壤酚类物质与微生物群落均未达到显著相关(P0.05)。冗余分析表明,0—5 cm层土壤中的阿魏酸、2,4-二羟基苯甲酸和β-谷甾醇均对真菌群落和F∶B有显著影响(P0.05),而在10—20 cm层中,只有β-谷甾醇影响了微生物群落的生长。土地利用方式的变化改变了表层土壤的酚酸物质含量和微生物群落结构,酚酸物质对表层土壤各类群的微生物量有明显的促进作用,但抑制了深层土壤微生物的生长。     

GnRH-a对子宫内膜异位症患者血清CA125、EMAB及RANTES的影响

目的:探讨促性腺激素释放激素激动剂(Gn RH-a)对子宫内膜异位症患者血清CA125、EMAB及RANTES的影响。方法:选取我院收治的子宫内膜异位症患者92例,根据治疗方法不同分为两组,对照组予以常规治疗,治疗组在对照组基础上加用醋酸亮丙瑞林微球注射治疗。检测两组患者治疗前后血清CA125、EMAB及RANTES水平。结果:与治疗前相比,两组患者治疗后CA125、RANTES明显降低,EMAB转阴率明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与对照组相比,治疗组患者治疗后CA125、RANTES水平降低,EMAB转阴率升高,差异有统计学意义(P0.05);治疗组不良反应发生率低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:Gn RH-a能够降低子宫内膜异位症患者血清CA125、RANTES及EMAB水平,提高机体免疫功能,安全性较高,对临床具有指导意义。     

Zn~(2+)在菹草叶片中的积累及其植物毒理学效应

以广泛分布的沉水植物--菹草为研究对象,通过添加不同浓度Zn2+(0、5、10、15和20 mg·L~(-1))的10% Hoagland营养液培养7 d,分析Zn~(2+)在水生植物中的积累及其诱导产生的毒理学作用.结果发现:随着培养液中Zn~(2+)浓度的增加,(1)菹草叶片中Zn~(2+)含量极显著上升.(2)Zn~(2+)处理使菹草产生明显的矿质营养失衡症状,主要表现为显著增加了对Fe~(2+)的吸收和降低了对P~(5+)和Na~+的吸收.(3)光合色素中,叶绿素a和b、类胡萝卜素先升后降,分别在5、5和10 mg·L~(-1)处理浓度时最多;叶绿素a/b一直下降.(4)GSH含量在5 mg·L~(-1)时达到峰值后减少,而AsA则为逐渐降低.(5)各处理浓度都使ATP和可溶性蛋白含量明显减少.(6)电镜观察发现,正常条件下Ca~(2+)主要分布在胞间隙和液泡中,细胞基质中较少;添加Zn~(2+)后,胞间隙和液泡中的Ca~(2+)逐渐进入细胞质,使细胞质中Ca~(2+)浓度明显升高,在质膜内侧、细胞核和叶绿体中都出现大量呈圆环状的黑色钙颗粒.综合分析认为,AsA对Zn~(2+) 胁迫反应最敏感,Zn~(2+)对菹草产生毒害的临界浓度为5～10 mg·L~(-1).     

大鼠低氧诱导因子-1α基因克隆和表达载体的构建

目的:对低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因进行克隆及载体构建,为进一步研究HIF-1基因转染骨髓基质细胞移植治疗脊髓缺血再灌注损伤提供实验依据.方法:制备大鼠脊髓缺血再灌注模型,提取脊髓组织mRNA,进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PR)合成HIF-1α cDNA,并对其进行PCR扩增,对PCR产物进行纯化及连接T载体、转化感受态和双酶切鉴定,并将HIF-1α克隆入pcDNA3.1载体.结果:PCR扩增的片段长度为2472bp与预期结果一致;利用BamHI和XbaI双酶切能够切出大小约2472bP的目的片段,与PCR产物片段大小相等,经测序证实无碱基改变.结论:成功克隆HIF-1α,并被构建到载体pcDNA3.1中,为进一步研究基因转染奠定了基础.     

大鼠低氧诱导因子-1α基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:将大鼠低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)基因转染到骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),为后续基因修饰的BMSCs移植治疗脊髓缺血再灌注损伤提供必要的理论依据.方法:采用直接贴壁法分离,传代培养出纯化的大鼠BMSCs;用电穿孔的方法将构建好的大鼠HIF-1α基因表达栽体转染入BMSCs中;通过免疫细胞化学法,鉴定HIF-1α能否成功转染进入BMSCs;RT-PCR检测转染前后HIF-1α在细胞中的表达效果.结果:直接贴壁法能有效分离、纯化大鼠BMSCs;免疫细胞化学法显示转染后BMSCs内充满蓝紫色深染颗粒;RT-PCR结果显示,转染后细胞内HIF-1α基因表达量明显增高.结论:大鼠HIF-1α基因通过电穿孔方法可成功转染到符合试验标准的BMSCs中,并且稳定表达,为进一步研究修饰后HIF-1α基因对BMSCs增殖带来的影响以及治疗相关疾病等方面奠定基础.     

HIF-1基因转染骨髓间充质干细胞治疗SCII的展望

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCII)作为原发性脊髓损伤后的继发性损害是造成神经细胞损伤的一个重要因素,目前基因和细胞移植治疗SCII尚处于探索阶段.低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)产生并处于缺氧应答的关键环节,在缺血后细胞凋亡及微循环的重建等方面起关键作用,用其转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)进行细胞移植治疗SCII,可有望取得新的突破.