黄瓜叶片蛋白质双向电泳样品分级优化

以‘津研4号’苗期叶片为材料,采用聚乙二醇(PEG)分级沉淀法对黄瓜叶片蛋白质样品进行分级分离,将黄瓜叶片中存在的高丰度蛋白1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶特异性地集中于一个组分之中,以提高对黄瓜叶片蛋白质双向电泳中低丰度蛋白质的检测率.结果表明:(1)分级后各组分和全蛋白在SDS-PAGE谱带中差异显著,全蛋白得到了有效的分离.(2)二维电泳图谱上点的分辨率有很大的提高,所有组分的点数是未分级前的3倍之多.(3)浓度为24％的PEG-4000富集高丰度蛋白Rubisco的效果最好.该方法可推广应用于黄瓜叶片蛋白质组分析的样品制备.     

共表达ETEC K99、GFP重组大肠杆菌的构建及表达北大核心

[目的]构建K99、GFP基因重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中表达。[方法]利用PCR扩增技术扩增K99基因和GFP基因,经连接和转化将目的片段克隆到pLA载体上,利用双酶切技术及PCR技术对重组质粒进行鉴定并测序分析,利用Western Blot技术分析蛋白质表达情况。[结果]测序分析结果表明,基因具有正确的阅读框;双酶切和PCR鉴定得到498 bp和720 bp的特异性条带;荧光检测表明重组菌表达了蛋白;Western Blot结果表明重组菌表达为融合蛋白。[结论]成功构建了大肠重组菌,并表达外源融合蛋白。     

半干旱草原土壤呼吸组分区分与菌根呼吸的贡献

土壤呼吸组分的区分对于理解地下碳循环过程非常重要。而菌根真菌在地下碳循环过程中扮演着重要的角色, 但是有关菌根呼吸在草原生态系统中的研究相对较少。该研究在内蒙古半干旱草原应用深浅环网孔法, 结合浅环、深环(排除根系)和一个带有40 μm孔径窗口的土壤环(排除根系但是有菌根菌丝体)将根和菌丝物理分离, 来区分不同的呼吸组分。结果表明: 异养呼吸对总呼吸的贡献比例为51%, 根呼吸的贡献比例为26%, 菌根呼吸的贡献比例为23%, 菌根呼吸的比例3年变化范围为21%-26%。与国内外研究相比, 此方法提供了一个相对稳定的菌根呼吸测量精度范围, 在草原生态系统中切实可行。对菌根呼吸的准确定量将有助于预测草原生态系统土壤碳释放过程对未来气候变化的响应。     

响应面优化超声辅助提取香菇多糖的工艺研究(英文)

为确定香菇多糖的最佳提取工艺,利用响应面分析法对香菇多糖的提取工艺进行优化。在单因素实验的基础上,以超声时间、超声功率、浸提温度和浸提时间为响应因素,多糖提取得率为响应值,根据正交旋转组合试验设计原理进行四因素三水平的响应面分析。实验结果表明,采用超声功率174.94 W,超声时间为18.94min,在80.71℃下提取3.01 h,得到的香菇多糖提取率最高,为9.61%。当香菇多糖的浓度为3 mg/mL,其·OH清除率为52.1%。     

FSHβ 基因PCR-SSCP多态性及其与济宁青山羊高繁殖力关系的研究

采用PCR-SSCP技术检测促卵泡素b亚基(follicle-stimulating hormone β, FSHβ)基因5′调控区、外显子1和外显子2在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)和低繁殖力山羊品种(辽宁绒山羊、波尔山羊、安哥拉山羊)中的单核苷酸多态性, 同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明: 山羊与绵羊的FSHβ 基因该段核苷酸序列同源性为98%。9对引物中, 只有P9的扩增片段存在多态性。P9的扩增片段在济宁青山羊和辽宁绒山羊中检测到AA、AB和AC 3种基因型; 在波尔山羊中检测到AA、CC和AC 3种基因型; 在安哥拉山羊中检测到AA、BB、CC、AB、AC和BC共6种基因型。测序分析发现BB型与AA型相比在外显子2的第94 bp处有G→A突变, 并引起氨基酸改变(丙氨酸→苏氨酸); CC型与AA型相比在外显子2的第174 bp有一处C→T沉默突变。济宁青山羊AA、AB和AC基因型频率分别为0.686、0.137和0.177。AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.78只(P<0.05), 比AC基因型的多0.64只(P<0.05)。     

弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PD）是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR) 的基因dhaT,序列显示与来源于C.freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78%。将此基因构建于表达载体pSE380,得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E.coli JM109中进行了表达,重组酶通过镍柱及Sephacral S-300进行纯化,重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8.0,对丙醛的Km值为10.05mmol/L,最大反应速度Vmax为37.27umol/ min /mg;以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10.5,对1,3-PD的Km值为1.28mmol/L,最大反应速度Vmax为25.55umol/min/mg。重组酶的还原反应比活为49.50U/mg,氧化反应比活为79.72U/mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。此研究为工程菌高效生产1,3-PD奠定了基础。     

sTNFRⅡ和VIP融合蛋白的基因克隆表达、纯化及活性检测

可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ（sTNFRⅡ）和血管活性肠肽（VIP）对类风湿性关节炎（RA）均有治疗作用,但两者的作用机制不同。制备两者融合表达蛋白,可能具有更好的防治类风湿关节炎的作用。用含有VIP全基因序列的上游引物和sTNFRⅡ的下游引物,用PCR扩增出由连接序列将VIP和sTNFRⅡ基因连接的片段,再亚克隆到原核表达载体pET32a,在大肠杆菌DH5α内诱导表达。表达的产物经离子交换、疏水层析纯化,并用体外中和试验检测其活性。结果显示：构建的pET32a-VIP-sTNFRⅡ表达载体在大肠杆菌DH5α内包涵体表达,离子交换层析纯化后的融合蛋白有较强的生物活性,为将来应用打下基础。     

乙型肝炎病毒X蛋白定量试验与临床研究

HBV X蛋白 （HBx）是由乙型肝炎病毒（HBV）基因组编码的调控蛋白,与由乙肝引起的肝癌发生具有密切的关系。血清HBx对乙型肝炎、肝癌的诊断及发病机理研究有较高的临床应用价值。在表达并纯化HBx、制备出HBx单克隆抗体与酶标抗体的基础上,研制了HBx定量检测试剂盒（增强化学发光法）,对其灵敏度、特异性等指标进行分析,并将该试剂盒应用于临床研究。结果表明,原核表达并纯化的HBx纯度≥94%;试剂盒灵敏度达0.1ng/ml;线性范围达到0.5ng/ml -600ng/ml;特异性高,与球蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酸性糖蛋白、HBc、HBe、HBs、HBV preS2不发生交叉反应;批间CV≤6.5%;临床标本检验慢性乙型肝炎阳性率为55%、肝硬化阳性率为68%、肝癌阳性率70%,表明此试剂盒可应用于乙肝、肝硬化、肝癌的临床诊断及发病机理研究。     

促血管生成素-2检测试剂盒的研制和临床研究

促血管生成素2（angiopoietin-2, Ang-2）是特异性血管生成刺激因子,仅在恶性肿瘤细胞中高表达,与肿瘤血管形成数量和预后关系密切。血清Ang-2对恶性肿瘤的早期诊断及发病机理研究有较高的临床应用价值。本研究在表达并纯化Ang-2、制备Ang-2单抗的基础上,研制了Ang-2定量检测试剂盒（增强化学发光法）,对其技术指标进行分析,并将该试剂盒应用于妇科恶性肿瘤的临床研究。结果表明,原核表达并纯化的Ang-2纯度≥92%;试剂盒灵敏度达0.1ng/ml;线性范围达0.5-25ng/ml;与脂蛋白、球蛋白、α1酸性糖蛋白、血红蛋白、粘蛋白、透明质酸、癌胚抗原不发生交叉反应;批内变异系数（CV）≤4.1%;妇科恶性肿瘤临床标本检验,宫颈癌阳性率为73.2%,卵巢癌阳性率为83.3%,子宫内膜癌阳性率为76.7%,其它妇科恶性肿瘤阳性率为70.4%,表明该试剂盒为恶性肿瘤的临床诊断奠定基础。     

中国粉蚧属一新纪录种(半翅目,蚧总科,粉蚧科)

菲律宾粉蚧Pseudococcus philippinicus Williams,2004为中国新纪录种。重描了雌成虫的形态特征,首次记述了各龄若虫的形态特征,绘制了各龄的形态特征图,拍摄了各虫龄的外形照片。最后,还编制了粉蚧属中国已知种类检索表。