牦牛乳酸脱氢酶B基因突变体的克隆鉴定研究

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实牦牛（Bos grunniens）乳酸脱氢酶存在两种类型,根据LDH同工酶谱的特点推测牦牛LDH多态是由B基因变异所致,并由此将凝胶电泳中迁移率快的LDH同工酶谱带称为LDH－Bf类型,迁移率慢的称为LDH－Bs类型．为阐明牦牛LDH变异体的分子机制,实验从牦牛心脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法分别克隆了LDH－Bf和LDH-Bs两种类型的B基因cDNA全长序列;序列比对分析发现LDH-Bf和LDH-Bs基因存在4个碱基差异;依据cDNA序列推导的氨基酸序列的比对分析,发现两者之间存在两个氨基酸差异;利用Deepview分子建模软件进行的牦牛H亚基及LDH1突变体的高级结构预测,发现突变的两个氨基酸都能产生新的H键,影响整个蛋白分子的H键网络,并进一步导致蛋白分子空间结构的变化．     

P-body及其与mRNA的转录后调节之间的关系

mRNA在真核生物基因表达的转录后调控中发挥着重要作用.然而最新研究发现,一种被命名为P-body胞浆复合体是mRNA转录后调控过程中的一个重要场所,在基因表达过程中起到了至关重要的调控作用.该复合体富含多种功能的蛋白,同时还有细胞因子与RNA等成分组成,其功能特征为参与mRNA降解、翻译抑制、mRNA监视以及RNA介导基因沉默等重要生命活动过程.研究发现,P-body是特化的细胞成分.本文详细阐述P-body的发现、结构特征以及与mRNA转录后调控的关系,使人们对P-body的生物学功能有更深入地了解和认识,另一方面将有助于更进一步深入探讨基因的表达调节机制..     

慢病毒导入型人白细胞介素10基因表达质粒的构建及其对CCI大鼠的镇痛作用

目的：构建含人白细胞介素10基因的慢病毒载体LV-hIL-10,观察鞘内注射LV—hIL-10对坐骨神经松结扎模型（chronic constriction injury,CCI）大鼠的镇痛作用。方法：应用PCR从pCYIL-10质粒上扩增hIL-10基因,把hIL-10基因亚克隆至pWPXL质粒上得到重组质粒pWPXL-hIL-10,将pWPXL-hIL-10与psPAX2、pMD2．G共转293T,收集上清浓缩后制备LV-hIL-10。同时将空质粒pWPXL-GFP与psPAX2、pMD2．G共转293T,收集上清浓缩后作实验对照。纯种健康清洁级成年雄性SD大鼠135只,随机分为9组：CCI疼痛模型4组（C0、C1、C2、C3）,假手术4组（S0、S1、S2、S3）和正常对照组（N组）。给药组在蛛网膜下腔分别注射LV-hIL-10（C1组、S1组）、LV-GFP（C2组、S2组）、生理盐水（C3组、S3组）,对照组C0组、S0组不做鞘内置管,不给药。各组在手术造模成功实施鞘内注射后观察LV-hIL-10组不同时间点痛阈的改变及脊髓、脑皮质、海马中的hIL-10mRNA和蛋白表达。结果：获得IL—10基因片段,成功重组pWPXL-hIL-10载体,经序列验证无误。质粒共转染293T细胞后,获得了高滴度（2×10^10）、高纯度的LV-hIL-10病毒颗粒。CCI大鼠鞘内注射LV-hIL-10后痛觉异常明显缓解,脊髓、脑皮质、海马中的IL-10表达上调,脊髓中IL-10表达上调最显著。结论：鞘内注射慢病毒感染导入型人IL-10表达质粒对CCI大鼠有明显镇痛效应。     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因的克隆及序列分析

目的-克隆阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(AK)基因,并测定其序列,进行序列分析。方法-根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T simple载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性。结果-PCR扩增得到特异的阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的PT-AK重组质粒。测序表明,所克隆的AK基因大小为690bp,编码229个氨基酸。序列分析表明,所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性(99．9％)。结论-克隆了阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因,序列测定及同源性分析表明,所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性。     

生物芯片技术研究进展

生物芯片主要包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等。利用生物芯片技术可以从整个基因组的水平上对基因进行快速分析、筛选。本文主要概述了生物芯片技术的最新研究进展及在各个领域内的应用 ,并对生物芯片技术面临的挑战以及未来的发展方向作了讨论。     

可溶性TRAIL蛋白的高密度培养及补料策略研究

采用分批补料的方法高密度培养重组大肠杆菌C600/PbvTRAIL制备人可溶性TRAIL蛋白,优化发酵工艺,探索简单高效的分离纯化方法并测定蛋白生物活性。通过比较几种不同的补料策略：间歇流加、Dostat、pHstat,摸索了一种流加策略,即DOstatpHstat组合流加,有效的避免了发酵过程中,尤其是诱导表达阶段乙酸积累的增加,使TRAIL蛋白在高密度培养条件下,得到高效表达。菌体密度最终达到300g/L（WCW）以上,可溶性TRAIL蛋白占菌体总蛋白的4.2%,含量为1.1g/L。在整个发酵过程中,乙酸浓度接近于0,且未使用任何特殊手段,如纯氧、加压等,简化了发酵工艺,降低了发酵成本,为TRAIL的工业化生产创造了条件。     

漆酶工程菌株的构建及其培养条件的研究

提取产漆酶白腐菌 (Fomelignosus)的总RNA ,利用RT_PCR的方法克隆到漆酶的cDNA ,并将其克隆到表达载体pPIC9k ,重组质粒经线性化、电激转化PichiapastorisGS115、通过底物显色反应筛选到漆酶生产工程菌株。其中 2 #工程菌株产酶活力较高。培养基、培养温度、诱导用甲醇浓度及培养基中铜离子浓度对该菌产酶活力均有一定的影响。在最适条件下 (用含 2 0 0 μmol LCu2 的BMMY培养基 ,于 2 0℃ ,2 5 0r min ;用 0 5 %甲醇诱导 )培养至第 6天时 ,该菌株产酶活力达到最高 (15 10U L)。     

结合CA-125, PA, 腹水，卵巢癌偏侧性建立人工神经网络模型对上皮性卵巢癌结直肠转移进行预测诊断

摘要 目的：基于上皮性卵巢癌患者的最优临床指标建立人工神经网络模型（ANN''s Model）,预测卵巢癌患者结直肠转移情况,以期在降低诊断成本的同时,能够更好地进行结直肠转移风险预估,为个体化治疗方案的制定提供参考。方法：采用回顾性研究对2015年1月至2019年11月期间由哈尔滨医科大学附属第一医院、哈尔滨医科大学附属第二医院和哈尔滨医科大学附属肿瘤医院收治的801例确诊为上皮性卵巢癌患者的血清肿瘤标志物等临床常用血液指标进行分析,其中2015年1月至2017年12月所收集的附属肿瘤医院病例资料做建模组（534例）, 2018年1月至2019年11月所收集的附属一院及附属二院病例资料做外部验证组（267例）。利用Medcalc V15.2.0.0软件计算建模组534例卵巢癌患者包括血常规、尿常规、肝肾功、肿瘤标记物、凝血象等临床指标曲线下面积（area under the curve, AUC）,筛选出结直肠转移相关指标;Graphpad Prism V6.0软件计算结直肠转移相关指标共线性,进一步获得结直肠转移相关优势指标来构建ANN模型,并用最优ANN模型对267例外部验证组卵巢癌患者结直肠转移进行预测,验证其能效。结果：血液学指标AUC结果显示CA-125和血清前蛋白（Prealbumin, PA）AUC值分别为0.68、0.67（P均<0.0001）,为人工神经网络模型优势参数,纳入CA125、PA建立ANN I模型AUC值为0.716（P<0.0001）,其对卵巢癌结直肠转移预测的敏感性及特异性分别为69.81%、62.50%。在ANNI模型基础上进而结合术中卵巢癌发生偏侧性（单侧卵巢受累或双侧卵巢受累）、有无腹水情况所建立ANN II模型AUC值为0.745（P<0.0001）,其对卵巢癌结直肠转移预测的敏感度及特异性分别为65.38%、78.24%。结论：1).卵巢癌伴结直肠转移患者其血清CA-125升高更明显,PA降低更明显。伴有腹水及双侧卵巢受累的上皮性卵巢癌患者,更易出现结直肠转移。2).根据卵巢癌患者治疗前CA-125、PA所建立的人工神经网络模型ANN I及在ANNI基础上进一步结合卵巢癌偏侧性及腹水情况所建立的人工神经网络模型ANN II,其二者对上皮性卵巢癌结直肠转移有一定预测能效,且预测性能较单独的CA-125及PA更为理想,为上皮性卵巢癌结直肠转移临床预测提供参考。     

青藏高原高寒草地植物物种丰富度及其与环境因子和生物量的关系

在青藏高原进行了大范围的群落调查 ,研究高原的两种主要草地群落类型———高寒草甸和高寒草原的植物物种丰富度及其变化。结果表明 :(1)在 5 0个样地 2 5 0个 1m× 1m的样方中 ,共出现 2 6 7种植物 ,其中高寒草甸179种 ,高寒草原 135种。在高寒草甸 ,1m2 样方内物种数最多为 32种 ,最少的仅为 3种 ;在高寒草原 ,物种数最多为 18种 /m2 ,最少的仅为 2种 /m2 。 (2 )物种丰富度随经度和纬度的增加呈增加趋势 ;随海拔的上升呈减少趋势。对物种丰富度与环境因子之间进行逐步回归 ,发现物种丰富度与生长季降水和温暖指数呈显著正相关。 (3)物种丰富度与地上生物量呈显著正相关。     

L型氨基酸对烟草赤星病菌毒素毒性的影响

为确定不同氨基酸对烟草赤星病菌产生的毒素毒性的影响,作者采用摩擦接种处理法、浇根处理法、种子根处理法三种生物测定方法,确定了以烟草种子根处理法作为烟草赤星病菌的毒性测定方法。用12种氨基酸分别以5种不同浓度与AT毒素混合接种,根长测定结果表明：L-谷氨酰胺,L-天冬酰胺,L-组氨酸所有供试浓度均增强病原菌毒素的毒性,而其余9种L型氨基酸对烟草赤星病菌GL-6产生的毒素有抑制作用,其中L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸适宜浓度可明显降低供试病原菌毒素对烟草的致病性,与对照差异极显著,其有效浓度分别为0．02mg／ml、0．02mg／ml、0．02～2mg／ml。