肿瘤特异性蛋白B7-H4纳米抗体的筛选和鉴定

羊驼体内存在天然缺少轻链的重链抗体,克隆重链抗体可变区(VHH),即可构建单域抗体(single-domain antibodies,sdAbs),又称纳米抗体(nanobody,Nb)。利用非免疫羊驼噬菌体文库筛选肿瘤特异性蛋白B7-H4的纳米抗体,经过4轮淘选,ELASE鉴定阳性克隆噬菌体,测序获得其DNA序列后体外转录为mRNA,将修饰纯化后的mRNA转染到肿瘤细胞,利用细胞免疫荧光检测mRNA在肿瘤细胞内是否表达,Western印迹进一步验证其表达情况;通过CCK-8法鉴定其对肿瘤细胞的增殖抑制能力;划痕实验鉴定其对肿瘤细胞迁移能力的影响;Transwell法鉴定其对肿瘤细胞的侵袭能力的影响;裸鼠荷瘤模型瘤旁注射mRNA,鉴定其在体内实验对肿瘤组织的作用。结果显示,通过淘选获得1个高亲和性的噬菌体株菌H6;DNA测序并导出的氨基酸序列符合羊驼纳米抗体结构;将其mRNA导入肿瘤细胞,能有效表达出纳米抗体H6;转染H6-mRNA的肿瘤细胞(0.84±0.08)与未转染H6-mRNA的对照组(1.83±0.04)相比,其增殖能力明显受到抑制,P<0.01,其迁移和侵袭能力(78.60±5.36)明显低于空白对照组(197.80±21.04),效果优于B7-H4 mRNA的siRNA(95.40±16.56);在裸鼠乳腺癌模型中能有效抑制肿瘤生长,效果优于紫杉醇和B7-H4 mRNA的siRNA。这说明筛选所得抗B7-H4纳米抗体H6能特异结合B7-H4蛋白并封闭其功能,导致肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭受到抑制。该结果为利用B7-H4作为治疗癌症的靶点提供了实验基础。     

探访世界恐龙之都

正德拉姆黑勒(Drumheller)位于加拿大阿尔伯塔省(Alberta)东南部,名字源于1910年购买此地并开采煤矿的Colonel Samuel Drumheller。小镇不大,红鹿河(Red deer river)自西向东穿镇而过,这里起初为不毛之地,被称为Badland。因在晚白垩世地层中发现煤矿,人数随之逐年增加,最多时为1万多人,并曾短暂地改名为德拉姆黑勒市(加拿大政府规定一个地区人口超过1万     

不同地区舟山种和孟加拉种眼镜蛇的神经毒素

先前的工作发现 ,眼镜蛇孟加拉种的神经毒分布存在明显的地理差异 ,但是导致这种现象的原因还不是很清楚。该工作首先采集夏季的眼镜蛇种 ,进行分类学的鉴定 ,以排除因为种属分类、季节和年龄而导致的不确定因素对蛇毒成分产生影响。再从鉴定好的成年浙江舟山种和云南孟加拉种眼镜蛇蛇毒中分离获得短链神经毒素 ;同时采用RT PCR方法得到相应的基因。结果从浙江舟山种眼镜蛇蛇毒中分离到两个神经毒素 ;从云南孟加拉种蛇毒中得到三个神经毒素。这些神经毒素都是短链神经毒素。说明该两个蛇种与已经报道的台湾及浙江的舟山种眼镜蛇很相似 ,蛇毒中都以短链神经毒素为主。另外泰国孟加拉种眼镜蛇蛇毒中则以长链神经毒素为主。这种现象很难用种群发生的前后或者地理距离的长短来解释 ,而可能与地区间的气候、地理环境或者眼镜蛇的食物差别相关。实验统计表明在云南、浙江和台湾这些条件基本相似 ,而泰国就有很大的不同。     

湖南烙铁头蛇毒中一个新的舒缓激肽增强肽（TmF）

通过 70 %冷甲醇抽提、SephadexG 15分子筛和反相高效液相色谱C1 8层析 ,从湖南产烙铁头蛇毒 (Trimeresurusmucrosquamatus)冻干粉中纯化得到一个新的舒缓激肽增强肽 (BPP) ,命名为TmF。该小肽的氨基酸序列为pGlu Gly Arg Pro Leu Gly Pro Pro Ile Pro Pro (pGlu表示焦谷氨酸 )。序列结果分析表明 ,TmF和已经分离得到的BPPs有很高的序列同源性。MSI MS测定其分子量为 1.110 7kD。TmF的生物学活性和药理学活性检测的结果表明 ,它增强舒缓激肽 (BK) ( 1mg L)诱导的离体豚鼠回肠纵行肌收缩的活性为 ( 1.13± 0 .3)单位 (mg L) ;TmF ( 5 .0× 10 - 4mg kg)可以增强约 ( 14± 2 )mmHg的由BK( 5 .0× 10 - 5mg kg)诱导的舒张压下降 ;在抑制剂试验中 ,不同剂量的TmF和 5× 10 - 2 mg的血管紧张素转化酶保温 30min ,结果表明大约2 .0× 10 - 3mg的TmF表现出对ACE水解活性的半数抑制率 (IC50 )。     

鸡胚胎干细胞多能性相关基因cNanog和cPouV干扰载体的构建及筛选

旨在构建靶向鸡胚胎干细胞多能性相关基因cNanog和cPouV的siRNA表达载体,并在体外检测其对cNanog和cPouV表达的抑制作用。分别选择cNanog和cPouV中3个区域合成寡聚核苷酸构建siRNA表达载体,同时构建cNanog和cPouV全基因表达载体来检测基因表达下调的效果。经Western blotting检测显示,所构建的siRNA表达载体可在293T细胞内表达siRNA或shRNA,诱发RNA干扰效应,从而抑制目的基因cNanog和cPouV的表达。不同位点的寡核苷酸序列抑制效率不同,其中pS3-cNanog和pS3-cPouV重组质粒的干扰效果和抑制效率最好。研究结果为后续得到稳定干扰cNanog和cPouV基因的重组载体和进一步研究cNanog和cPouV基因功能奠定了基础。     

南岳衡山珍稀濒危野生植物资源调查

2008—2010年,对南岳衡山野生植物资源进行了实地调查,调查结果表明:南岳衡山有国家重点保护野生植物17种,其中一级保护3种,二级保护14种。国家珍稀濒危植物14种。列入2007年《中国物种红色名录》中受胁威的珍稀濒危植物87种,其中极危1种,濒危13种,易危36种,近危26种,无危11种。兰科植物23属46种,且具有附生、地生和腐生各种生态类型。另外对银杏、伯乐树居群进行了分析,得出南岳衡山是银杏野生居群保存和现代分布地区之一,保存在该区的银杏,伯乐树的天然林应为原始林的残遗成分,具有古老和残遗特性。     

不同添加物对小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1合成苦马豆素的影响

苦马豆素(swainsonine,SW)是由小花棘豆等疯草植物中内生真菌通过酵母氨酸还原酶催化产生的一种吲哚里西啶生物碱,牲畜过量采食含SW的疯草植物会中毒,但是SW具有抗肿瘤和免疫调节活性等医学作用。文中以小花棘豆内生真菌野生株OW7.8及其酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1为研究对象,在固体培养基中添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、赖氨酸和哌啶酸培养内生真菌野生株和突变株,利用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术测定SW,比较不同培养时间下内生真菌野生株和突变株中SW合成动态变化,并对所得数据用统计学软件进行方差分析。研究结果显示:对照组OW7.8中SW含量高于M1;添加前体物可提高菌体内SW的含量;不同前体对SW合成的影响不同,其中添加哌啶酸对SW影响最大。统计学分析结果表明:菌株(基因型)、添加前体化合物对真菌SW合成均有显著影响。     

脑肿瘤靶向递药策略及其研究进展

脑肿瘤严重威胁人类生命,其特有的屏障结构阻碍了药物有效进入。以脑胶质瘤为例,对现有脑肿瘤主要靶向策略作一简要综述, 并提出了脑肿瘤靶向递药的新理念——系统靶向（或全过程靶向）递药,即集脑肿瘤发生发展各阶段特征靶向策略于一体,设计对脑肿瘤 发生发展各阶段具有靶向功能的纳米递药系统,以实现更为有效的脑肿瘤靶向治疗目标。     

血管紧张素Ⅱ持续皮下灌泵诱导Apo E-/-小鼠建立腹主动脉瘤模型的探讨

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)皮下灌泵诱导Apo E-/-小鼠建立腹主动脉瘤模型的特点和可行性。方法:选取8-10周龄雄性Apo E-/-小鼠,通过植入式微量渗透释放泵皮下泵入AngⅡ(1000 ng/kg·min),持续泵入28天;对照组小鼠泵入生理盐水28天。取材后,测量小鼠腹主动脉直径,固定包埋做石蜡切片进行HE及弹力纤维染色,用Real-time PCR方法检测腹主动脉中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果:AngⅡ处理组小鼠成瘤率为80%,腹主动脉直径较生理盐水对照组明显增加(P0.05);病理染色显示炎症细胞明显增多,弹力纤维断裂增多,胶原合成增多。小鼠腹主动脉α-SMA m RNA表达较对照组显著降低(P0.05),而OPN m RNA表达较对照组明显增高(P0.05)。结论:通过AngⅡ连续灌注28天可以诱导Apo E-/-小鼠发生腹主动脉瘤,腹主动脉平滑肌细胞由收缩型向分泌型转化可能作为小鼠腹主动脉瘤发生的鉴定及治疗靶点之一。     

一种用于穿透多肽筛选的随机文库的构建及筛选

以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)为示踪物,在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法,从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽（cell-penetrating peptide, CPP）. 采用点突变技术,首先在pET-14b载体多克隆位点NdeⅠ和XhoⅠ之间加入4个限制性内切酶位点,随后在BamH Ⅰ位点后加入三联终止密码子,接着再利用亚克隆的方法在Kpn Ⅰ 和XhoⅠ之间插入EGFP,形成一个新的用于原核表达示踪蛋白的载体pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用点突变技术在上述构建的示踪载体的多克隆位点XhoⅠ和BamH Ⅰ之间插入36个随机碱基序列.以His-Tat-EGFP作为工具建立有效的筛选方法,利用这种方法对文库进行筛选. 酶切和测序表明,示踪载体的构建是正确的,且在大肠杆菌中可有效地表达出His标记的EGFP.在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库至少包含了10⁵个独立克隆,其中90%以上的克隆插入的随机片段都是36个碱基.建立的筛选方法是可行的,并用此方法进行了初步的筛选.