鹅源新城疫病毒拯救体系的建立

参照GenBank上公布的鹅源新城疫病毒ZJI株全序列,设计8对引物,经RT-PCR法从尿囊液中扩增目的片段后,分别克隆进pCR2.1载体,将Ⅰ～Ⅶ7对引物的扩增片段依次亚克隆到TVT7R转录载体中,构建了含NDV全基因组cDNA的转录载体(pNDVZJI),将Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ3对引物的扩增片段分别克隆进pCR2.1载体,并亚克隆到表达质粒pCI-neo上,构建了L基因的真核表达载体(pCI-L),pNDVZJI、pCI-L与另外两个辅助表达质粒(pCI-NP和pCI-P)共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了具有血凝性的鹅源新城疫病毒,ZJI株鹅源新城疫病毒的成功拯救为后续相关研究工作的开展打下了基础。     

用单克隆抗体研究鸡新城疫病毒抗原变异与流行病学的相关性

用19株抗鸡新城疫病毒(NDV)单克隆抗体(简称单抗)测定与14个NDV国际参考株和16个NDV国内分离株的反应性,将毒株分为a～h 8个群。该组单抗能较精细地测出流行病学上不同的毒株间的抗原变异,毒株分群显示了抗原变异与流行病学特征的相关性。     

南极菌产琼胶酶aga3311的表达、性质及其降解特性

【目的】本文通过对具有琼胶降解能力的南极菌Pseudoalteromonas sp.NJ21全基因组进行生物信息学分析,筛选获得琼胶酶疑似序列aga3311,采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行了验证和分析。【方法】首先对aga3311进行克隆和表达;采用Ni-NTA对重组酶进行纯化;DNS-还原糖法测定重组酶的酶学性质;用薄层层析(TLC)和质谱(MS)技术对Aga3311的酶解产物进行分析。【结果】构建的重组表达质粒p ET-30(a)+aga3311能够在工程菌E.coli BL21(DE3)中实现高效表达,其中可溶性表达为30%左右;纯化的重组酶Aga3311分子量为87 k Da,其最适作用温度为35°C,30–45°C的范围内稳定性较高,50°C则迅速失活,具有热不稳定的特征;最适p H为7.0,在p H 4.0–10.0的范围内仍能保持50%以上的活性;金属离子Fe~(3+)、Be~(2+)、Zn~(2+)和Ca~(2+)均能显著提高Aga3311的活性,特别是Ca~(2+)使其酶活提高1倍。该酶的酶解终产物经TLC和质谱分析主要为新琼二糖。【结论】重组酶Aga3311为Glyco_hydro_42家族的外切型β-琼胶酶,能够特异性降解琼脂糖生成新琼二糖。     

玉米籽粒灌浆特性对播期的响应

以‘京科528’(JK528)和‘郑单958’(ZD958)为试验材料,设置早春播(4月10日播种)和春播(5月14日播种)2个播期处理,研究不同播期条件下玉米的籽粒灌浆特性.结果表明: JK528、ZD958在早春播条件下的最终百粒重和产量显著高于春播,增幅分别为6.8%和10.1%、17.8%和9.2%;籽粒最大灌浆速率(G_max)、平均灌浆速率(G_ave)表现为早春播高于春播,而籽粒活跃灌浆期(P)呈相反趋势;JK528百粒重和产量显著高于ZD958,其中JK528百粒重和产量较ZD958高7.4 g和1189.6 kg·hm^-2,增幅分别为21.6%和10.8%;P表现为ZD958大于JK528,而W_max、G_max、G_ave和T_max表现为JK528大于ZD958;同一播期,JK528在灌浆中期的平均灌浆速率高于后期,且高于ZD958.相关分析表明,籽粒干物质积累量与平均气温和积温间呈极显著正相关.可见,充分利用光热资源,提高灌浆速率,有利于获得较高粒重,从而提高玉米产量.JK528在灌浆前中期灌浆速率快的优势弥补了其灌浆活跃期略短的情况,进而在不同播期条件下均可获得较高的粒重.     

标记抗体染色病毒空斑计数技术的研究

用细胞病变阳性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ,ＣＰＥ＋ ）病毒马立克氏病毒（Ｍａｒｅｋ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ, ＭＤＶ）血清１,２,３ 型以及细胞病变阴性（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ,ＣＰＥ－ ）病毒猪瘟病毒（Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）强毒与弱毒和鸡新城疫病毒（Ｎｅｗ ｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ． ＮＤＶ）Ｌａｓｏｔａ 毒株及其对应的异硫氢酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的特异抗体为试验材料,以免疫荧光抗体技术（ＦＡ）为基础、并加以改进,建立了标记抗体染色病毒空斑计数技术． 该技术不仅能克服常规病毒空斑计数技术不能计数细胞病变阴性病毒和一种样品含有两种或两种以上病毒的各自空斑数的缺点,能迅速准确计数出ＣＰＥ－ 病毒和多病毒样品中病毒各自空斑数及其空斑总数,具较高敏感性、良好的可重复性．     

大肠杆菌SLTIIvB基因的克隆和表达

采用聚合酶链式反应(PCR),从大肠杆菌O.138基因组DNA中分别扩增出志贺菌样毒素II型变体B的结构序列和包括信号肽的全序列两段基因,定向克隆进表达载体质粒pYA3334(asd\++)的EcoRI\,BamHI位点之间,构建成重组表达质粒。在大肠杆菌X6212(Δasd)筛选出重组质粒pB\-0和pB\-1后,经中间宿主X3730转化过渡,再导入ΔasdΔcyaΔcrp减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,构建成宿主和载体之间具有平衡致死结构的SLTIIvB重组菌。SDSPAGE和Westernblot分析重组菌X4550(pB\-0)在76kD左右处有一条特异性蛋白条带。动物免疫试验表明该重组菌能刺激机体产生针对SLTIIvB和沙门氏菌的特异性抗体。这为进一步研制相应的抗猪水肿病及相应沙门氏菌病的双价活疫苗奠定了重要基础。     

H9N2禽流感病毒反向遗传系统转录/表达载体的构建和验证

设计带有BsmBI、BsaⅠ或AarⅠ酶切位点的引物,用RT PCR扩增H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的8个基因全长片段,克隆入双向转录/表达载体pHW2000,并在PB2、PB1和NA基因中共引入了3个沉默突变标签.将其2个表面基因(HA和NA基因)加上任意1个内部基因,而其它5个内部基因来自A/WSN/33,进行了6种3+5组合形式的基因重排,把相应组合的转录/表达质粒共转染COS-1细胞,均产生了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒,表明亲缘关系遥远的流感病毒可以互相获取基因片段产生重组病毒,提示表面结构基因和单个内部基因不足以限制H9N2 AIV在哺乳动物细胞上的宿主范围,同时也验证了构建的8个转录/表达载体均能有效工作,为进一步研究H9N2亚型AIV基因结构与功能、AIV与宿主之间的关系打下了基础.     

伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统对SopE表达影响的初步研究

为探索伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统(type 6 secretion system, T6SS)对SopE表达的影响,阐明其中的分子机制,本研究利用自杀质粒同源重组法构建携带sopE∷3×Flag的伤寒沙门菌野生株(WT-pBAD33)、T6SS功能分子缺陷株(ΔsciG-pBAD33)和回补株(C-ΔsciG),用构建成功的菌株感染巨噬细胞THP-1并在模拟巨噬细胞内环境(LPM培养基、微需氧)下培养,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)与蛋白质印迹法(Western blot, WB)试验探索T6SS对SopE表达的影响,采用β-半乳糖苷酶活性检测来进一步验证sopE基因启动子的转录水平,Ni柱纯化T6SS功能蛋白SciG,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)研究SciG蛋白对sopE基因启动子的调控作用。结果显示：ΔsciG-pBAD33中SopE表达水平较于WT-pBAD33明显降...     

饮用经臭氧处理的灭菌水与小鼠自发性乳腺肿瘤的发生

目的研究饮用经臭氧处理的灭菌水对小鼠自发性乳腺肿瘤发生的影响。方法给昆明(KM)小鼠、NIH小鼠和BALB/c小鼠饮用经臭氧处理的灭菌水,然后观察其乳腺肿瘤的发生情况,剖检小鼠并从其乳腺、左右肺叶、气管、肺门淋巴结、鼠蹊部淋巴结、心、肝、脾、肾、脑和大小肠等部位取材固定,常规病理制片进行病理组织学检查。结果饮用经臭氧处理的水数月后,KM小鼠、NIH小鼠和BALB/c小鼠,自发性乳腺肿瘤的数量明显增加。发生的乳腺肿瘤均为乳腺腺癌,其中一例为乳头状囊腺癌。乳腺肿瘤均发生在生育3～4胎以上的雌性小鼠。9例中有3例发生肺转移癌。根据乳腺肿瘤发生部位、大体形态特征及病理组织学,结合临床发病情况,即可明确诊断。结论长期饮用经臭氧处理的灭菌水可使小鼠自发性乳腺肿瘤的发生率明显上升。     

细胞自噬在大鼠缺血/再灌注肺损伤中的调控作用

目的: 探讨细胞自噬在大鼠缺血/再灌注肺损伤中的作用。方法: 随机将40只SD大鼠分为5组(n=8),分别为 ① 假手术组(Sham组):只开胸3.5 h;② 缺血/再灌注组(I/R组):开胸夹闭肺门缺血0.5 h后再灌注3 h;③ 溶剂组(DMSO组):术前1 h腹腔注射DMSO溶液;④自噬激动剂组(Rap组):术前腹腔注射雷帕霉素溶液;⑤自噬抑制剂组(3-MA组):术前1 h腹腔注射3-MA溶液;后三组的其余操作同I/R组。实验结束后处死大鼠,取肺组织,记录并计算肺组织湿/干重比(W/D)、总肺含水量变化(TLW) ,光镜和电镜观察肺组织及细胞形态,计算肺泡损伤率(IAR),Western blot检测自噬相关蛋白的表达情况。结果: 相对于sham组,其余四组肺W/D、TLW、IAR均明显升高,自噬相关蛋白表达明显上升,p-AMPK、Beclin 1、LC3 II 蛋白明显增多,p-mTOR、p62蛋白明显减少(P＜0.05或P＜0.01),光镜下其余各组肺组织有不同程度的水肿渗出,肺泡结构紊乱,电镜下细胞超微结构损伤加重,部分可见自噬小体;与DMSO组相比,3-MA组肺W/D、TLW、IAR明显下降(P＜0.05或P＜0.01),自噬相关蛋白表达明显下降,肺间质水肿较轻,细胞渗出较少,细胞超微结构损伤减轻,未见自噬小体。而I/R、DMSO、Rap组的各项指标变化无统计学差异(P＞0.05)。结论: 肺缺血/再灌注可诱发细胞自噬增强,从而引起大鼠肺损伤。