双杂交系统及其应用

双杂交系统是近年发展的一种研究蛋白质之间相互作用的新方法.它既可以分析蛋白质在体内的相互作用,又可以克隆与已知蛋白质相互作用的未知蛋白质基因.本文对其原理和具体应用作一综述.     

中亚林蛙的核型、C带和银带研究及田野林蛙起源的探讨

中亚林蛙（Rana asiatica）的核型为2n=26,NF=52。第2号染色体短臂有一条近端着丝粒区C带。第10号染色体长臂上有一对标准NORs。本文认为,田野林蛙（Rana arvalis）起源于欧洲,是欧洲林蛙群与亚洲2n=24的林蛙群间的过渡种类。The diploid number of Rana asiatica is 2n=26, NF=52,with an acrocetric C-band on 2p and a pair of standard NORs on 10q. The paper holds that Rana arvalis,originated in Europe, is a interim species between Rana group in Europe and Rana group in Asia with 2n=24.     

抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体——Ⅱ.抗体的鉴定

单克隆C17细胞所分泌的抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体,用固相放射免疫、放射性双扩散及硝酸纤维膜印迹实验,鉴定为阳性,能与此抗原特异地结合。经Protein A-SepharoseCL-4B分离提纯此抗体,再用兔抗鼠标准血清鉴定,其亚型为IgM。将此单克隆抗体偶联到Sepharose 4B上,将炭疽抗原过柱,然后把洗脱液进行电泳分析,证明C17分泌的抗体特异地针对炭疽保护性抗原中分子量为19,000道尔顿的组分。     

抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体——Ⅰ.杂交瘤细胞株的获得

用炭疽保护性抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合,融合剂为PEG1000。用放射免疫方法筛选分泌特异抗体的杂交瘤细胞后,经有限稀释法及再克隆选择单克隆细胞,获4株能产生抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经染色体组型分析,证明是杂交细胞。体外连续培养8个月,仍能持续稳定地分泌抗体。其中,C17杂交细胞株,从它冰冻保存的第20代细胞复苏后,又传30多代,并接种在小鼠腹腔内增殖,仍能分泌特异性抗体。用正向间接血凝法测定其培养上清液及腹水,抗体滴度分别为1:256～512,1:4,096～6,144。     

615小鼠白血病(L615)细胞株的建立

利用血细胞进行连续传代培养,建立细胞株是比较困难的。但是,某些白血病,特别是病毒诱发的白血病,利用组织培养方法有可能建成悬浮式生长的细胞株。然而,这种细胞往往是不成熟的细胞。615小鼠白血病模型(L615)是我国建立的一株网织细胞型白血病实验模型(用津638病毒诱发产生的)。我们用这个材料体外培养14个月,细胞传代120代,建成了一个静置悬浮培养的白血病网织型细胞株。它除了包含有白血病615小鼠原Bj标记染色体之外翻,在第1对染色体中的一条丢失了一段,第6对染色体中的一条形成一个亚中着丝点染色体。我们将这株培养细胞定名为L615细胞株。     

不同养分和水分管理模式对水稻抗倒伏能力的影响

大田试验下,通过对水稻茎秆基部物理性状、形态特征和硅、钾含量的测定和比较,系统研究了不同养分和水分管理模式对水稻茎秆抗倒伏能力的影响．结果表明,有机无机肥配施,特别是秸秆与化肥配施(CS)养分模式可明显提高水稻植侏茎秆粗度、茎壁厚度和茎重,从而有效提高了基部茎秆的抗折力(RS)和明显降低了水稻的倒伏指数(LI),秸秆与化肥配施(CS)养分模式对水稻抗倒伏能力的效果在干湿交替(AWD)和控水模式(DRA)下表现更为明显。有机无机肥配施,特别是秸秆与化肥配施(CS)的养分模式在干湿交替(AWD)和控水模式(DRA)下更有助于提高水稻茎秆的硅、钾含量、相关分析表明,水稻基部茎秆茎壁厚度、茎重和抗折力与茎秆硅、钾含量存在显著(P<0．05)或极显著正相关(P<0．01)。     

罗汉果SgHMGR基因的克隆、分析及原核表达

罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于甲羟戊酸(MVA)途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点。为了深入了解罗汉果甜苷Ⅴ的生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR的unigene,以授粉后3 d的幼果作为实验材料,通过RACE技术获得了1 926 bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有1 749 bp的开放阅读框,编码582氨基酸残基,含2段跨膜区,分别位于50~72 aa和93~115 aa,亚细胞定位预测位于质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR基因的同源性最高。该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在25℃诱导过夜后上清中表达最明显。该文是首次对SgHMGR基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中的功能及分子调控研究打下基础。     

下颌第三磨牙拔除中预防下唇麻木和舌麻木的方法探讨

目的:探讨下颌第三磨牙拔除导致下唇和舌麻木的有关因素。方法:按照三种分类标准进行分组。第一种分组:以不同年龄段分成两组。第二种分组:以下颌第三磨牙根尖与下颌神经管的关系分成三组。第三种分组:以不同拔牙方法分为三组。结果:1.下颌第三磨牙拔除后引起下唇麻木和舌麻木与年龄无明显关系。2.460例下颌第三磨牙拔除术后出现下唇麻木31例(占6.74%),其中第二组和第三组占26例(占5.65%),第一组和第二组分别与第三组相比具有统计学意义(P0.05);出现舌神经损伤17例(占3.70%),其中第二组和第三组占14例(占3.04%),第一组和第二组分别与第三组相比具有统计学意义(P0.05)。3.口腔全景片显示的66例下颌第三磨牙根尖与下颌神经管重叠中,CBCT显示根尖多位于下颌神经管舌侧,而跨于下颌神经管最少见。4.拔牙方法越复杂,引起下唇和舌麻木的几率就越大。结论:本组病例的方法评估对拟定合适的治疗方案和安全指导拔牙以降低下唇和舌麻木具有重要的临床意义。     

AdEasy重组腺病毒系统对Ad-HIF1α的构建和鉴定

目的:采用AdEasy重组腺病毒系统构建重组腺病毒Ad-HIF1α并进行鉴定。方法:使用高保真PCR从EST克隆中扩增HIF1α基因编码区,并用限制性内切酶BamH I和Xba I对PCR片段限制性酶切,用T4 DNA连接酶将其连接至同样经BamH I和Xba I限制性酶切的穿梭载体pAdtrace-TO4,构建穿梭载体pAdtrace-HIF1α;将pAdtrace-HIF1α与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌BJ5183中同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd-HIF1α;pAd-HIF1α经Pac I酶切后转染至E1表达包装细胞系HEK293中进行HIF1α基因表达腺病毒包装,重复扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,获得高滴度Ad-HIF1α;感染干细胞株C3H10T1/2,通过荧光蛋白的表达了解其感染效率,并应用PCR及Western blot验证目的基因的表达,并通过检测下游靶基因VEGF的表达,了解该载体表达的目的蛋白的生物活性。结果:重组腺病毒质粒pAd-HIF1α,经PCR及酶切分析验证构建正确;在HEK293中进行HIF1α基因表达腺病毒包装,经反复冻融4次使细胞裂解,获得高滴度重组腺病毒载体;通过红色荧光蛋白(Red fluorescence protein,RFP)表达,观察到Ad-HIF1α能够高效感染C3H10T1/2细胞,并通过PCR证实了HIF1α在C3H10T1/2细胞较对照组明显高表达;在感染Ad-HIF1α的C3H10T1/2细胞中,HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达明显增高,证实表达的目的蛋白具有生物活性。结论:应用AdEasy重组腺病毒系统成功构建Ad-HIF1α,并证实其具有生物活性,为后续研究奠定了基础。     

黑果枸杞原生质体培养及植株再生

该研究以黑果枸杞(Lycium ruthenicum)无菌苗为材料,建立了愈伤组织来源的原生质体再生体系,采用ISSR和FCM技术对再生植株进行了遗传稳定性分析。结果表明：(1)黑果枸杞叶片愈伤组织是产生原生质体的最好材料,在含0.5 mg·mL^-1甘露醇的酶液中,继代1次的叶片愈伤组织中原生质体产量为7.77×10⁶个·g^-1,活力为92%。(2)改良MS培养基 固体液体双层培养(MS₂ 固液双层)是培养原生质体的最好方式,培养10 d的原生质体分裂频率为45.9%,培养20 d的细胞团形成频率为22.9%。(3)在1.5 mg·mL^-1 6 BA+0.1 mg·mL^-1 IBA+MS培养基中,叶片愈伤组织产生的原生质体可分化获得再生植株。(4)ISSR分析显示,再生植株的平均遗传相似系数为0.88;FCM显示再生植株为二倍体,与亲本植株一致。该研究结果为进一步研究枸杞体细胞杂交技术转移野生植物抗逆遗传性状提供科学依据,为枸杞优良品种的选育奠定了基础。