人参皂甙Rb1对大鼠慢性缺氧性认知功能障碍的治疗作用

目的：目前尚无特效的防治慢性缺氧性认知功能障碍措施,前人的研究提示人参皂甙Rb1可能有上述功效,故本实验拟研究人参皂甙Rb1对大鼠慢性缺氧性认知功能障碍的治疗作用及其可能机制。方法：取雄性成年SD大鼠30只,随机分为对照组、模型组、人参皂甙Rb1（2 mg/kg·d）治疗组。采用Morris水迷宫行为学实验检测大鼠学习记忆功能,运用膜片钳技术在脑片水平检测海马的突出可塑性。结果：（1）模型组大鼠寻找平台潜伏期较对照组显著延长（P〈0.05）,在目标象限的停留时间较对照组明显缩短（P〈0.05）,人参皂甙Rb1治疗后,大鼠寻找平台潜伏期较模型组缩短（P〈0.05）,在目标象限的停留时间较模型组延长（P〈0.05）;（2）在高频强直刺激（HFS）作用下,各组均有长时程增强（LTP）现象,但模型组LTP较对照组明显减弱（P〈0.05）,人参皂甙Rb1治疗后LTP明显增强（P〈0.05）。结论：人参皂甙Rbl减轻了慢性缺氧大鼠在水迷宫实验中的行为学改变,并增强了慢性缺氧大鼠海马LTP,证实人参皂甙Rbl可明显减轻大鼠慢性缺氧性认知功能障碍,该作用与其减轻海马LTP抑制有关,为高原缺氧性认知功能障碍的防治提供了新思路,但其具体机制尚有待于进一步研究,本室将在此基础上进一步深入研究人参皂甙Rbl改善慢性缺氧性认知功能障碍的机制。     

2个芹菜品种泛变应原Api g 4基因的克隆与分析

从芹菜(Apium graveolens Linn.)品种‘津南实芹’(‘Jinnanshiqin’)和‘美国西芹’(‘Meiguoxiqin’)中分别克隆获得泛变应原基因Api g 4;2个品种的Api g4基因均包含1个长度为405 bp的开放阅读框,二者间有3个核苷酸位点的差异.2个品种的Api g4基因均能编码134个氨基酸,但二者编码的氨基酸序列有2个位点的差异.多重比对以及进化树分析结果均表明:2个芹菜品种Api g 4基因编码的氨基酸序列与其他植物的泛变应原氨基酸序列同源性较高,氨基酸序列高度保守;与同科植物欧芹[Petroselinum crispum (Miller) Nyman ex A.W.Hill]和胡萝卜(Daucus carota Linn.)的泛变应原氨基酸序列的同源性均达到90％以上,在进化树上也归为同一支.2个品种的泛变应原Api g 4均为疏水性蛋白,具有相似的三维空间结构,均包含3个α螺旋和7个β折叠.实时定量PCR分析结果显示:Api g 4基因在‘津南实芹’和‘美国西芹’根中的表达水平均最高,在茎和茎尖分生组织中的表达水平相对较低,在叶中的表达水平很弱,且2个品种间同一组织的Api g4基因表达水平也有差异,表明Api g 4基因的表达具有明显的组织特异性.     

水芹类黄酮3'-羟化酶基因的克隆与表达特性分析

类黄酮3'-羟化酶(flavonoid 3′-hydroxylase,F3'H)属于细胞色素P450家族(cytochromeP450,CYP450),在植物主要成色物质花青素的合成中发挥重要作用。本实验以‘八卦洲水芹’以及紫色叶柄突变型水芹为实验材料,利用RT-PCR方法,从紫色叶柄突变型水芹的cDNA中克隆得到编码类黄酮3'-羟化酶的基因,命名为OjF3'H1。序列分析显示,OjF3'H1基因全长1575bp,共编码524个氨基酸。OjF3'H1蛋白相对分子质量为58292.59,理论等电点为6.77。系统进化分析显示,OjF3'H1蛋白具有高度保守性,与同属伞形科的胡萝卜F3'H1进化关系最近。OjF3'H1编码的蛋白属于疏水蛋白,无序化比例为5.53%,空间结构主要由α-螺旋和β-折叠组成。实时定量PCR分析显示,OjF3'H1在不同品种水芹茎中相对表达量有明显差异,紫色叶柄突变型水芹中OjF3'H1的表达量明显比‘八卦洲水芹’中高。     

胡萝卜低温胁迫转录因子DcICE1基因克隆与非生物逆境响应分析

植物ICE1基因是调控CBF基因表达的上游调控因子,在植物抵抗逆境胁迫中具有重要的作用。该实验以2个胡萝卜品种‘黑田五寸’和‘君川红’为实验材料,分别克隆出DcICE1转录因子基因,并通过荧光定量PCR方法测定了4种不同逆境胁迫下(4℃低温、38℃高温、0.2mol·L-1 NaCl及200g·L-1 PEG)DcICE1基因的表达情况,探讨DcICE1转录因子在植物抵抗非生物胁迫下的功能。序列分析显示,该基因全长1 458bp,编码485个氨基酸。2个胡萝卜品种的DcICE1基因在核苷酸水平上有2个位点的差异,分别为第139位的G/A和第475位的A/G,导致编码的氨基酸在第47位的E/K和第159位的N/D差异,该差异可能与DcICE1转录因子在2个不同品种应对逆境胁迫下的响应不同有关。胡萝卜DcICE1转录因子有一个保守的ICE1功能结构域。实时定量PCR检测DcICE1基因在不同逆境胁迫下的响应表明,低温(4℃)处理能明显地诱导DcICE1基因的表达,但盐(0.2mol·L-1 NaCl)和干旱(200g·L-1 PEG)处理下的诱导效果均不明显。     

侧脑室注射共轭亚油酸(CLA)对大鼠糖脂代谢的影响

观察侧脑室注射共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)对SD大鼠糖脂代谢的影响及其可能的机制。方法:向正常SD大鼠侧脑室内注射共轭亚油酸(CLA),分别于注射后2、4、8、12、24小时采血,试剂盒法测血糖、胰岛素、瘦素、血甘油三脂、血胆固醇、血高密度脂蛋白。48小时后处死,分离动物的脂肪(皮下、内脏、肾周、睾周)进行称重,计算体脂比。结果:与对照组相比,侧脑室注射CLA48小时后,大鼠脂体比、皮下脂肪、睾周脂肪均下降。术后2-12h血糖降低,血清胰岛素浓度也降低,而且持续的时间较长(48h)。侧脑室注射CLA对脂代谢有影响,2h时血清甘油三酯升高、胆固醇降低、4h时高密度脂蛋白升高。结论:共轭亚油酸能够通过中枢神经系统调节外周糖脂代谢,这可能与其能减轻体重的机制有关。     

膳食甘油二酯对SD大鼠食欲及下丘脑神经肽Y基因表达的影响

研究膳食甘油二酯对SD大鼠食欲和下丘脑神经肽Y基因表达的影响。方法:将大鼠随机分成三组:5%(wt)甘油三酯组(对照组),20%(wt)甘油三酯组(TG组)和20%(wt)1,3—甘油二酯组(DG组)。大鼠喂养10W,每天记录进食量,每周称体重,于第10周末处死大鼠,称体重和内脏脂肪,计算脂体比,测定血糖、血脂和各种激素水平,RT-PCR的方法检测大鼠下丘脑神经肽Y mRNA表达水平。结果:高甘油二酯组与高甘油三酯组比较,改善体重的增加及内脏脂肪的积累,降低大鼠血糖、血甘油三酯(TG)、胰岛素水平,同时降低大鼠下丘脑神经肽Y mRNA的表达水平。结论:甘油二酯降低脂肪积累和改善血脂水平的可能机制是改变下丘脑有关控制食欲的基因表达,进而影响了脂肪代谢的平衡。     

外源核酸促核辐射鼠肠腺细胞修复的基因分析

初步探讨外源核酸促电离辐射损伤的小鼠肠腺细胞修复的分子机理.建立BALB/c小鼠电离辐射后给予外源RNA与生理盐水治疗的6 h、12 h、24 h、4 d和8 d的模型,采集空肠组织标本后采用消减杂交基础上的LD-PCR技术,获取与受照小鼠肠腺损伤修复相关的基因克隆,对其进行全自动序列分析与GenBank检索.6 h治疗组同源性较高的序列主要为：热休克蛋白mRNA、Nmi mRNA、Dutt1蛋白mRNA、Na,K-ATPase γ亚单位mRNA等;12 h治疗组同源性较高的序列为：碱性磷酸酶mRNA、碱性磷酸酶2、glkA基因、单链复制着丝粒基因等;24 h治疗组同源性较高的序列为：抗CEA单链抗体重链可变区基因、抗DNA重链可变区基因、Ig kappa链mRNA等;4 d治疗组同源性较高的序列为：双特异性磷酸酶、端粒酶相关蛋白家族mRNA、β-GABA转运基因、紧张激活蛋白mRNA、FK506结合蛋白、Ca²⁺/Ca²⁺调蛋白依赖性基因等;8 d治疗组同源性较高的序列为：免疫球蛋白可变区基因、鼠免疫球蛋白DNA、易弯曲肽DNA、tsr glkA基因、修复蛋白A等.新发现的18个基因片段递交给GeneBank,接受号为AF240164-AF240181.结果表明：外源核酸促电离辐射损伤的小鼠肠腺修复的机理可能与一些基因、蛋白质的异常表达有关,与免疫系统的作用可能有关.     

自噬在高压氧预处理预防脊髓缺血再灌注损伤中 的作用机制研究*

目的:研究自噬在高压氧预处理预防脊髓缺血再灌注损伤中的机制。方法:新生大鼠脊髓神经元原代培养,分为对照组(氧糖剥夺)和高压氧(HBO)预处理组。通过应用免疫组织化学、Western blot分析两组LC3-Ⅱ与凋亡相关分子Beclin-1,Bcl-2,Casp-ase-3的表达变化。结果:发现重复高压氧预处理对氧糖剥夺诱导原代培养的脊髓神经元损伤具有明显的保护作用。免疫组化和Western blot显示与对照组相比高压氧预处理显著增加脊髓神经元细胞Bcl-2的表达,降低Beclin-1,Caspase-3以及自噬的特异性标记蛋白LC3-Ⅱ的表达。氧糖剥夺后对照组与高压氧组相比,LDH释放量明显增多(P<0.05)。结论:HBO预处理通过调节自噬减轻缺血再灌注损伤,为HBO预处理神经保护提供一条新的作用机制。     

大鼠CRIP2蛋白的表达和分离纯化

目的:获得大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌中表达、纯化大鼠CRIP2(cysteine-rich intestinal protein 2)蛋白。方法:从大鼠主动脉组织中提取总DNA,RT-PCR扩增出相应大小的crip2 DNA片段,与pGEM-T-easy载体连接后测序;将测序正确的crip2按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白,通过镍柱进行纯化。结果:PCR获得的crip2序列与GenBank报道的一致(为707 bp);重组融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶形式高效表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,在相对分子质量为27×103处有特异的蛋白条带,经镍柱纯化后,得到了高纯度的CRIP2融合蛋白。结论:克隆了大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度的CRIP2融合蛋白。     

3个芹菜品种Agnp-G3PDH基因的克隆及其序列和表达特性分析

从芹菜(Apium graveolens Linn.)品种‘六合黄心芹’(‘Liuhe Huangxinqin’)、‘津南实芹’(‘Jinnan Shiqin’)和‘文图拉’(‘Ventura’)中分别克隆获得非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因Agnp-G3PDH。3个品种的AgnpG3PDH基因序列均包含1个全长1 491 bp的开放阅读框(ORF),编码496个氨基酸;存在84个碱基位点差异,导致14个氨基酸位点改变。由该基因编码的‘六合黄心芹’、‘津南实芹’和‘文图拉’的Agnp-G3PDH蛋白的理论相对分子质量分别为53 201.6、53 051.4和52 960.3,理论等电点分别为pI 7.49、pI 7.86和pI 8.12,氨基酸组成中碱性氨基酸数量大于酸性氨基酸数量;该蛋白质具有亲水性与疏水性双重特性,均为疏水性蛋白。多重比对结果表明:3个品种Agnp-G3PDH基因编码的氨基酸序列同源性达到99.09%,具有高度保守性;且与其他11种植物npG3PDH的氨基酸序列的相似度也较高。在基于np-G3PDH基因编码的氨基酸序列进化树上,3个芹菜品种聚在同一分支中,并与杨柳科(Salicaceae)种类毛果杨(Populus trichocarpa Torr.&Gray)聚在一起,表明它们的np-G3PDH进化关系较近。实时定量PCR分析结果表明:在3个芹菜品种的不同组织中Agnp-G3PDH基因的相对表达水平均有明显差异,其中,在‘津南实芹’的叶、‘文图拉’的花和‘六合黄心芹’的根中该基因的相对表达水平最高;经高温(38℃)、低温(4℃)和干旱(20%PEG)胁迫处理后3个品种Agnp-G3PDH基因的相对表达水平均极显著高于或低于对照,但经盐(0.2 mol·L-1NaCl)胁迫处理后仅品种‘津南实芹’Agnp-G3PDH基因的相对表达水平显著高于对照,品种‘六合黄心芹’和‘文图拉’Agnp-G3PDH基因的相对表达水平与对照无显著差异。表明该基因的表达具有组织特异性且与品种间的抗逆性差异有关。