2个芹菜品种泛变应原Api g 4基因的克隆与分析

从芹菜(Apium graveolens Linn.)品种‘津南实芹’(‘Jinnanshiqin’)和‘美国西芹’(‘Meiguoxiqin’)中分别克隆获得泛变应原基因Api g 4;2个品种的Api g4基因均包含1个长度为405 bp的开放阅读框,二者间有3个核苷酸位点的差异.2个品种的Api g4基因均能编码134个氨基酸,但二者编码的氨基酸序列有2个位点的差异.多重比对以及进化树分析结果均表明:2个芹菜品种Api g 4基因编码的氨基酸序列与其他植物的泛变应原氨基酸序列同源性较高,氨基酸序列高度保守;与同科植物欧芹[Petroselinum crispum (Miller) Nyman ex A.W.Hill]和胡萝卜(Daucus carota Linn.)的泛变应原氨基酸序列的同源性均达到90％以上,在进化树上也归为同一支.2个品种的泛变应原Api g 4均为疏水性蛋白,具有相似的三维空间结构,均包含3个α螺旋和7个β折叠.实时定量PCR分析结果显示:Api g 4基因在‘津南实芹’和‘美国西芹’根中的表达水平均最高,在茎和茎尖分生组织中的表达水平相对较低,在叶中的表达水平很弱,且2个品种间同一组织的Api g4基因表达水平也有差异,表明Api g 4基因的表达具有明显的组织特异性.     

芹菜韧皮部蛋白基因的分离与表达分析

韧皮部蛋白在维持植物形态,物质转运以及植物伤口保护等方面起着重要作用。本研究以地域来源和性状特性差异均较大的两个芹菜品种‘六合黄心芹’和‘美国西芹’为试验材料,利用RT-PCR技术获得这两种芹菜韧皮部蛋白基因的cDNA序列。结果显示：这两种芹菜来源的韧皮部蛋白基因全长均为546 bp,编码181个氨基酸。两者核苷酸序列有3个位点的不同,分别为：88G/A、399T/C和489T/C;在氨基酸序列上有一个位点的不同,为30T/A。预测其蛋白质分子量为19 kD,pI值为9.18。‘六合黄心芹’和‘美国西芹’的韧皮部蛋白与忽地笑等植物的韧皮部蛋白相似度较高,在保守位置分别具有5个亮氨酸残基和4个色氨酸残基。实时定量PCR表达分析表明,该基因主要在芹菜的茎和根等部位表达,具有明显的组织特异性。     

芹菜品种‘六合黄心芹’ AgCCoAOMT基因的克隆及表达特性分析

根据伞形科( Apiaceae)植物芹菜( Apium graveolens Linn.)的转录组数据库,从芹菜品种‘六合黄心芹’(‘Liuhe Huangxinqin’)叶片总RNA中克隆获得咖啡碱-辅酶A-O-甲基转移酶基因,命名为AgCCoAOMT基因。序列分析结果表明：AgCCoAOMT基因包含1个长度726 bp的开放阅读框( ORF),编码241个氨基酸;该基因编码的蛋白质为AgCCoAOMT,其理论相对分子质量为27010,理论等电点pI 5.35;在AgCCoAOMT蛋白中,酸性氨基酸所占比例高于碱性氨基酸,脂肪族氨基酸所占比例约为芳香族氨基酸的3倍;该蛋白属于疏水性蛋白,并含有1个保守的AdoMet MTases结构域,说明AgCCoAOMT蛋白属于AdoMet MTases超级家族;AgCCoAOMT蛋白的三级结构包含多个a-螺旋和β-折叠,与紫花苜蓿( Medicago sativa Linn.) CCoAOMT蛋白三级结构的一致性为84.58%。多重比对和系统树分析结果表明：AgCCoAOMT蛋白有较高的保守性;该蛋白与同科植物大阿米芹( Ammi majus Linn.)和欧芹﹝Petroselinum crispum ( Mill.) Nyman ex A. W. Hill〕CCoAOMT蛋白的进化关系最近,与睡莲科( Nymphaeaceae)植物莲( Nelumbo nucifera Gaertn.) CCoAOMT蛋白的进化关系较近。 qRT-PCR检测结果表明：AgCCoAOMT基因能够在‘六合黄心芹’的根、茎、叶柄和叶片中表达,且在叶片中的相对表达量极显著(P<0.01)高于其他组织,说明该基因的表达具有明显的组织特异性;不同生长发育阶段该基因在叶片中的相对表达量有明显差异,其在商品期(播种后第65天)的相对表达量极显著高于幼苗期(播种后第25天)和生长旺盛期(播种后第45天)。研究结果显示：AgCCoAOMT基因与‘六合黄心芹’叶的老化和木质素含量升高有关,且在进化过程中具有较高的保守性。     

芹菜NHL-like蛋白基因克隆与表达分析

植物生长发育过程中会遭遇各种病原物的攻击,植物为了应对这些危害并适应外界的生存竞争,逐渐演化出了复杂的防御机制。NHL基因家族庞大,部分NHL基因受病原物诱导后会过量表达,增强植物对多种病原菌的抗性,是与植物防御机制密切相关的蛋白。本研究以津南实芹和美国西芹2个芹菜品种为试验材料,分别克隆出NHL-like蛋白基因AgNHL。序列分析表明,上述2种芹菜的AgNHL基因序列均含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。2种芹菜碱基序列,只有第36位不同,津南实芹为T,美国西芹为C,2种碱基序列相似性高达99.84%,编码的氨基酸序列相同。进化分析显示,2种芹菜的NHL-like蛋白与葡萄、大豆等植物的相似度较高,在第80~185氨基酸间含一个LEA-2蛋白保守结构域。荧光定量PCR结果表明,AgNHL基因主要在芹菜茎中表达,根中表达量最低,有明显组织特异性,品种差异也很显著。对2种芹菜分别进行4℃低温、38℃高温、20%PEG处理、0.2 mol/L NaCl处理2 h表达分析显示,低温、盐处理下该基因表达量明显上升。     

葡萄果实(E)-β-丁香烯合酶基因的克隆及其表达分析

利用生物信息学方法,通过电子克隆获得葡萄(Vitis vinifera Linn.) (E)-β-丁香烯合酶基因的cDNA序列;以从葡萄品种‘德引84-1’(‘Deyin 84-1’)果肉中提取的mRNA为cDNA模板,利用特异PCR技术克隆得到1个全长1 880 bp的基因,被命名为Vv-ECar(GenBank登录号JF808010),该基因序列包括开放阅读框1 674 bp、3’非翻译编码区209 bp和poly+ (A) 28 bp,可编码557个氨基酸.比对结果显示:葡萄Vv-ECar基因的核苷酸序列与葡萄VvGwECar2基因的同源性达93％,二者编码的氨基酸序列同源性达90.8％,均含有植物萜类合酶家族共有的保守域DDXXD;葡萄Vv-ECar与茶[Camellia sinensis (Linn.)0.Kuntze]和杨(Populus balsamifera subsp.trichocarpa×P.deltoids)的萜类合酶相关基因同源性均在73％以上;分子进化树的分析结果也显示葡萄Vv-ECar基因编码的氨基酸序列与其他植物的同源序列具有高度保守性.半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析结果显示:在葡萄果实发育的不同阶段均有Vv-ECar基因的表达,但其相对表达量随果实的发育呈先低后高的趋势,其中在幼果期相对表达量最高.     

棉花EIN3/EIL家族基因序列分析及GhEIL3基因克隆

该研究以拟南芥AtEIN3基因为探针,从陆地棉TM-1全基因组测序数据库中筛选其同源序列,序列分析得到16条具有EIN3结构域的基因序列。对陆地棉EIN3/EIL家族基因的基因结构、系统进化、序列相似性及结构域分布情况进行分析,发现它们与拟南芥EIN3/EIL家族基因在N端具有较高相似度,其中15条基因序列包含5个保守结构,1条包含4个保守结构。在此基础上,采用RT-PCR方法从抗枯萎病的陆地棉品种‘中棉所12’中克隆得到一个新的EIN3/EIL家族基因,命名为GhEIL3(GenBank登录号为KY072936)。序列分析表明:GhEIL3基因开放阅读框长1 092bp,编码363个氨基酸,含有一个EIN3结构域。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,GhEIL3基因在枯萎病菌诱导后呈上调表达,诱导后1h其相对表达量达到最大值,推测GhEIL3基因可能参与棉花对枯萎病菌的防御反应。     

桂花查尔酮异构酶OfCHI基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶CHI是花青素苷合成途径中的关键酶。为了解桂花花青苷的合成机理,该研究对3个桂花品种的花青苷含量进行了测定。结果显示:(1)‘橙红丹桂’花中的花青苷含量最高,‘金桂’和‘早银桂’中花青苷含量较低。(2)利用RACE和RT-PCR方法获得了桂花查尔酮异构酶基因(OfCHI)的全长cDNA序列1 069bp,该基因编码248个氨基酸,相对分子量为26.85kD,等电点为6.34。(3)多重序列比对显示,OfCHI与金花茶CnCHI、忍冬LjCHI、石榴PgCHI的相似性分别为68.13%、65.86%和63.53%,氨基酸序列中含有CHI蛋白的活性位点Thr47、Tyr108、Met115以及Ser192;系统进化树分析表明,OfCHI与其他物种起源相同,而与油橄榄OeCHI亲缘关系最近。(4)利用qRT-PCR对不同桂花品种、不同组织中OfCHI的表达量检测结果显示,OfCHI在‘橙红丹桂’花中表达量最高,在‘金桂’和‘早银桂’中表达量较低;OfCHI在‘橙红丹桂’、‘金桂’和‘早银桂’的花、茎、叶中均有表达,且表达趋势相同,均为叶中表达量最高。该研究为揭示桂花青素苷的合成机理奠定了理论基础,并为培育不同花色的桂花新品种提供了基因专利。     

黑粒青稞HvtUF3GT基因的克隆与表达分析

该研究以黑粒青稞品种‘黑老鸦’籽粒为材料,克隆了青稞类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因(HvtUF3GT),获得1 449 bp序列。HvtUF3GT基因包含一个1 434 bp开放阅读框,编码478个氨基酸,理论等电点为5.45,预测蛋白分子量为52 912.58 Da。蛋白质序列分析表明,HvtUF3GT为亲水性的不稳定酸性蛋白,且在C-末端具有一段典型的44个氨基酸PSPG box,在空间结构中含有β-α-β-α-βRossmann折叠结构,属于UDP糖基转移酶基因GT-B型超家族成员。进化树分析表明,HvtUF3GT与小麦族的大麦、乌拉尔图小麦、山羊草和二穗短柄草的糖基转移酶聚为一个分支,且与大麦的亲缘关系最近,与稻族的籼稻和短花稻的亲缘关系较远。半定量和定量PCR结果表明,在‘INB0N-7’蓝粒青稞和‘昆仑12号’白粒青稞的籽粒灌浆后期HvtUF3GT基因不表达,而在黑粒青稞和紫粒青稞中的表达强弱依次为‘黑老鸦’(黑粒)‘昆仑17号’(黑粒)‘达章紫’(紫粒)‘涅如姆扎’(紫粒)。研究推测,HvtUF3GT基因在青稞灌浆后期籽粒着色过程中发挥着重要作用。     

二氢黄酮醇还原酶基因在红肉萝卜和白肉萝卜中的序列变异和表达差异

二氢黄酮醇还原酶是植物花青素合成的关键酶。本研究以中国特有红肉萝卜种质‘心里美’为试材,克隆和分析其二氢黄酮醇还原酶基因(DFR)。通过与大白菜DFR基因的完整CDS序列及白萝卜自交系‘36-2’全基因组序列(未公布)进行比对,获得单一的同源序列Rsa10008592。参照该序列设计5’和3’引物,以‘心里美’萝卜自交系‘HX12Q-49’的cDNA为模板,通过RT-PCR和TA克隆获得ORF为1164 bp(Genbank登录号KF280272)、编码387 aa(Genbank登录号AGU42192)的RsDFR基因的完整CDS序列。通过对白萝卜‘36-2’的Rsa10008592和‘心里美’萝卜‘HX12Q-49’的RsDFR序列比较分析,发现二者之间存在19个核苷酸和3个氨基酸的差异。氨基酸序列进化树显示,‘心里美’萝卜的RsDFR与大白菜和芥菜的DFR同源性较高。荧光定量PCR发现RsDFR在白萝卜和‘心里美’萝卜不同发育阶段的表达模式不同,在白萝卜中仅在肉质根发育的早期表达,而在‘心里美’萝卜的全生育期均有表达,且在破肚期的表达量最高。同时,对‘心里美’萝卜RsDFR基因编码的蛋白质进行了初步分析。     

刺芹侧耳谷氨酰胺合成酶编码基因克隆和表达分析

谷氨酰胺合成酶（GS）是真菌氮素同化代谢和谷氨酸合成中的关键酶,采用3’RACE和5’RACE实验技术,克隆获得刺芹侧耳（杏鲍菇）谷氨酰胺合成酶编码基因（PE-GS）全长序列,长度为1 271bp,具有4个内含子和5个外显子,编码353个氨基酸残基。系统进化树分析表明,刺芹侧耳PE-GS与糙皮侧耳GS在分子进化关系上相近。通过real time RT-PCR方法对PE-GS基因在刺芹侧耳基质菌丝体和子实体中的表达情况进行了分析,结果表明,刺芹侧耳PE-GS基因在子实体具有较高的表达水平,这暗示刺芹侧耳PE-GS基因在子实体的氮素代谢中可能承担重要功能。     

Effects of abiotic stresses on the expression of Lhcb1 gene and photosynthesis of Oenanthe javanica and Apium graveolens

The effects of abiotic stresses on the expression of Lhcb1 gene (coding light-harvesting chlorophyll-protein complex II), and on photosynthetic rate were studied in one Oenanthe javanica (cv. Baguazhou Shuiqin) and three Apium graveolens cultivars (Liuhe Huangxinqin, Jinnan Shiqin, and Ventura). The Lhcb1 genes were cloned and we predicted that Lhcb1 proteins were most probably able to form homo-trimers. Each monomer contained five helical segments, of which three were likely transmembrane helices, and 15 putative chlorophyll-binding sites. The abiotic stresses affected the A. graveolens similarly in all the cultivars, however, the O. javanica photosynthesis was not significantly affected. The expression of the Lhcb1 gene was up-regulated under the cold, heat, salt, and drought stresses in the cvs Liuhe Huangxinqin and Jinnan Shiqin. The Lhcb1 was up-regulated under the heat, salt, and drought stresses in the cv. Ventura, whereas had no significant changes under the cold stress. No significant changes of the Lhcb1 expression were found under the cold and salt stresses and even little down-regulation following the heat and drought stresses in Oenanthe javanica. The expression of Lhcb1 may be a useful indicator of photosynthetic activity.     

茶树CsDREB-A1转录因子基因的克隆及其特性分析

基于茶树品种‘迎霜’（Camellia sinensis‘Yingshuang’）的转录组数据,采用PCR方法从其基因组DNA中克隆获得编码DREB转录因子的CsDREB-A1基因。结果显示：该基因的开放阅读框（ORF）长度为585 bp,编码194个氨基酸,该氨基酸序列即为CsDREB-A1转录因子。CsDREB-A1转录因子的N端含有AP2/ERF家族转录因子典型的AP2 DNA保守结合结构域,其中包含保守的YRG元件和WLG基序,且其第14位和第19位分别为缬氨酸和谷氨酸,该结构域的上、下游分别有PKK/RPAGRx KFx ETRHP和DSAW特征序列。通过进化分析可知CsDREB-A1转录因子属于AP2/ERF家族中DREB亚族的A1组,其与茶树CBF转录因子的相似性较高,与拟南芥〔Arabidopsis thaliana（Linn.）Heynh.〕等植物的DREB类转录因子也有较高的相似性。CsDREB-A1转录因子为亲水性蛋白,理论相对分子质量为21 165.4,理论等电点为p I 9.56,碱性、酸性、芳香族和脂肪族氨基酸比例分别为18%、10%、6%和18%;该转录因子只有1个包含53个氨基酸的无序化区域,且大部分无序化氨基酸位于AP2DNA保守结合结构域内,无序化氨基酸的比例为27.32%;在CsDREB-A1转录因子的三级结构中,N端有1个α螺旋、C端有3个β折叠。研究结果显示：CsDREB-A1转录因子可能与茶树的抗寒性相关。     

野生马铃薯ANS同源基因的克隆与表达分析

采用PCR和RT-PCR方法从野生马铃薯（Solanum cardiphyllum）分离得到了一个花色素合成酶（anthocyanidin synthase）同源基因ScANS的cDNA（GenBank登录号HQ701726）和DNA序列（GenBank登录号HQ701727）。序列分析表明,ScA册基因全长为1583bp,由一个内含子和两个外显子组成,开放阅读框长度为1365bp,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白。该蛋白分子量为51．10kDa,理论等电点为5．24。ScANS含有典型的20G—FeII-Oxy保守功能域,属于2-OOD酶家族,其氨基酸序列与茄子的同源蛋白序列一致性最高,达82．86％。组织表达分析表明,SScANS在马铃薯植株的茎、叶和顶芽中有较高水平的转录表达,在根中有微量表达,在匍匐茎和块茎中检测不到。     

球孢白僵菌Pr1蛋白酶基因cDNA克隆与序列分析

从球孢白僵菌菌株Bb202中克隆了昆虫蛋白酶Pr1的基因。使用特异性引物,分别以基因组DNA和mRNA为模板进行PCR反应,得到了球孢白僵菌的Pr1蛋白酶基因cDNA和结构基因序列。测序结果表明球孢白僵菌Pr1蛋白酶结构基因全长大小为1606bp,含有3个内含子,分别为69、61和68bp。其ORF全长1140bp,预测编码379个氨基酸残基。成熟蛋白理论分子量为38.8kD,理论等电点为8.06。为进一步研究球孢白僵菌Pr1基因,并构建高毒力工程菌株提供了理论基础。     

7个冬小麦品种灌浆期抗旱性鉴定指标的综合评价

采用7个冬小麦(Triticum aestivum L.)品种,研究了不同水分处理下部分生理指标和部分农艺性状变化,以各单项指标的抗旱系数作为抗旱性衡量指标,利用主成分分析对其抗旱性进行评价,同时将综合评价值(D值)与抗旱指数(DRI)进行相关性分析。结果表明:(1)与对照相比,干旱胁迫后的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、相对电导率、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量、可溶性糖含量、胞间CO2浓度(Ci)均有不同程度上升;根系活力、净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、株高、穗下节长度、叶面积、穗长、小穗数和穗粒数均下降;过氧化物酶(POD)活性和可溶性蛋白质含量在各品种间变化趋势不尽一致。(2)通过主成分分析综合评价值(D值),供试品种可分为3类:‘晋麦47’和‘小偃22’属于强抗旱型;‘矮抗58’、‘西农979’和‘西农509’属于中等抗旱型;‘郑麦366’和‘郑麦9023’属于弱抗旱型。(3)两种不同干旱胁迫下综合评价值(D值)与抗旱指数均显著相关(r分别为0.768和0.808,p0.05)。     

欧李果实发育期糖和酸组分及其含量的动态变化特性

以农大3号、农大4号、农大5号3个欧李品种为材料,测定果实发育过程中各组分糖、酸及总糖、总酸的含量,以明确欧李果实糖酸积累的动态变化特性.结果显示:(1)3个欧李品种果实成熟期糖含量、酸含量及糖酸比存在明显差异,其中农大3号品种的总糖含量最高,总酸含量最低,糖酸比值最高.(2)成熟期3品种各糖组分中均以果糖含量较高,葡萄糖和蔗糖含量较低,山梨醇含量微量;酸组分中均以苹果酸为主,柠檬酸少量.(3)3个品种果糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇含量在整个果实发育期均呈持续增加态势,并以果糖积累为主;农大3号果糖含量在8周后增幅明显高于另2个品种,且一直保持到果实成熟;3个品种蔗糖含量的变化趋势相近,在前期和中期增加缓慢,接近成熟的2～3周则迅速增加并占整个发育期积累量的70%以上.(4)3个品种酸含量的变化趋势较为相似,苹果酸和柠檬酸在果实发育的前期和中期含量均较低,在果实发育后期迅速增加,但接近果实成熟时又大幅下降.研究表明,果糖与苹果酸的含量及其动态变化是影响欧李果实糖酸比、决定果实风味的主要因素.     

石榴果色合成相关基因CHS和CHI的表达特性分析

花色苷是类黄酮家族中重要的一类次生代谢产物,对果实呈色起重要作用。CHS (查尔酮合成酶)和CHI (查尔酮异构酶)为花色苷合成提供了前体物质,是花色苷合成所不可或缺的。利用RT-PCR和RACE方法,本研究从石榴果皮中克隆了与花色苷合成相关的CHS基因和CHI基因的cDNA全长,同时采用qRT-PCR研究了这两个基因在三个不同色泽石榴品种‘红宝石’、‘水晶甜’、‘墨石榴’发育期内的表达模式,并分析了果皮花色苷含量变化与基因转录水平的关系。结果表明,石榴中CHS和CHI基因cDNA全长分别为1 197 bp和693 bp,分别编码398和230个氨基酸,命名为PgCHS和PgCHI,在GenBank中的登录号分别为KF841615和KF841616。在氨基酸水平上,Pg CHS与荔枝、葡萄、山竹等果树的同源性达到90%以上。Pg CHI与果树中龙眼、梨、美洲葡萄、桑树等同源性达到70%以上。qRT-PCR结果显示,CHS和CHI基因的表达模式随色泽发育期和品种不同而有差异。在‘红宝石’石榴中,该两个基因都有前期和后期两个表达高峰期;而‘水晶甜’石榴中这两个基因的表达高峰期均出现在中后期;‘墨石榴’发育初期时CHS和CHI的表达量最高,以后的表达量都较低。同一品种内,CHS和CHI的表达具有协同性,两者的协同性表达有利于花色苷及其他类黄酮相关产物的合成。3个品种中CHS和CHI基因的表达与花色苷的积累并不一致。