Ⅰ型单纯疱疹病毒感染的细胞培养系统的建立

目的:建立稳定的HSV-1感染的细胞培养系统,为HSV-1感染性皮肤病的基础及临床研究提供稳定的平台。方法:以猴肾细胞(Vero)为繁殖细胞,选择人鼻咽癌上皮细胞(Hep-2)为靶细胞,观察HSV-1在Hep-2株中的致细胞病变效应(CPE)。结果:HSV-1在Vero细胞中能稳定、大量地繁殖;HSV-1感染Hep-2细胞后可出现明显的细胞病变;结论:以Vero为繁殖细胞,Hep-2为靶细胞的稳定的细胞培养系统可作为HSV-1感染性皮肤病的基础及临床研究的平台。     

螺旋藻多糖抗单纯疱疹病毒作用的实验研究

在体外进行了钝顶螺旋藻多糖(polysaccharides fromSpirulina platensis,PSP)抗单纯疱疹病毒活性的研究。以不同剂量的PSP分别作用于HSV-1及HSV-2病毒复制周期的各个环节,以病毒半数感染量(TCID50),细胞病变效应(CPE),蚀斑形成单位(PFU),MTT染色细胞保护率(MTT法)作为评价指标,判断PSP的抗病毒效果;FQ-PCR检测PSP抗病毒作用的时效关系。结果表明PSP对Vero细胞毒性极低(TC50为1750μg/mL),对HSV-1及HSV-2均无直接灭活作用,可阻滞HSV-1及HSV-2病毒吸附和抑制感染细胞内病毒的复制,但不影响病毒的释放;FQ-PCR结果显示随着PSP浓度及作用时间的增加,PSP对HSV-1病毒DNA的抑制作用明显增强,具有良好的剂量和时效关系。提示PSP抗HSV-1及HSV-2病毒作用的机制与抑制病毒吸附和感染细胞内病毒的生物合成有关。     

栀子提取物ZG对副流感病毒1型感染后宿主细胞膜的影响

为了探讨栀子提取物ZG抗病毒作用的生物学机制,观察了栀子提取物ZG对副流感病毒1型(PIV-1)感染后宿主细胞膜电位、膜Na -K -ATP酶活性和膜流动性的影响。以氯化乙酰胆碱为阳性对照,采用荧光探针Di-BAC4(3)标记Hep-2细胞膜电位,借助流式细胞仪检测膜电位;定磷法,分光光度计检测Na -K -ATP酶活性;荧光探针NBD-C6-HPC标记细胞膜磷脂,以荧光漂白恢复法和激光扫描共聚焦显微镜检测膜流动性。结果显示:PIV-1感染后宿主细胞膜电位下降,处于超极化状态;膜Na -K -ATP酶活性显著增加,膜流动性显著降低。栀子提取物ZG作用后,对宿主细胞膜的超极化状态没有明显影响;对膜Na -K -ATP酶活性没有明显影响;而对膜流动性则有明显的恢复作用。阳性对照药乙酰胆碱能明显改善病毒感染后膜电位的超极化状态。PIV-1感染后膜电位、Na -K -ATP酶活性和膜流动性等细胞膜能态和功能的改变,可能为病毒感染的生物学机制之一;栀子提取物ZG可能是通过改善细胞膜流动性,维持细胞膜的正常功能来发挥抗病毒感染的作用,而与膜电位和膜Na -K -ATP酶活性等能态来源的环节可能无关。     

茜草对II型单纯疱疹病毒的体外生长抑制作用

茜草为常用中药。本研究发现,茜草的甲醇提取物在体外细胞培养上对HSV-2有明显的抑制作用。在Vero细胞上,病毒抑制数可达3个对数。病毒增殖抑制实验表明,该制剂确实抑制了HSV-2感染性病毒颗丝的产生。在不同的细胞系上进行比较,发现该制剂的抗病毒作用具有明显的细胞系依赖性。本文认为,茜草的甲醇提取物具有抑制HSV-2的作用,但其有效成分为何种,尚待进一步研究。     

人中性粒细胞多肽HNP1，3体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用

体外观察人中性粒细胞多肽1,3(Humanneutrophilpeptide,HNP1,3)及阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对单纯疱疹病毒-Ⅰ型(Herpessimplexvirus1,HSV-1)的抑制作用。以Vero细胞为靶细胞,用各种浓度HNP1,3与游离病毒颗粒(直接失活组)及感染病毒后的靶细胞(复制抑制组)进行相互作用,镜下观察各药物对HSV-1致细胞病变效应的抑制作用,并采用ELISA法测定感染48h后药物对HSV-1囊膜糖蛋白分泌的抑制作用。MTT法检测各药物对细胞的毒性作用。结果显示直接失活组中,HNP1,3可使HSV-1的致细胞病变效应减轻,对HSV-1直接失活的50%有效浓度(EC50)为8.1μg/mL、10.03μg/mL;复制抑制组中,ACV使HSV-1的致细胞病变效应减轻,EC50为0.68μg/mL。MTT检测结果表明HNP1,3在治疗浓度范围内无明显细胞毒性。以上结果表明HNP1,3除具有较强的抗菌作用和抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Humanimmunodeficiencyvirus1,HIV-1)活性外,还能失活HSV-1病毒颗粒,从而逆转病毒及其蛋白的病毒效应(致细胞病变)和抑制病毒蛋白质的合成。     

人中性粒细胞多肽HNP1,3体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用

体外观察人中性粒细胞多肽1,3(Human neutrophil peptide,HNP1,3)及阿昔洛韦(Acyclovir,ACV)对单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)的抑制作用.以Vero细胞为靶细胞,用各种浓度HN1,3与游离病毒颗粒(直接失活组)及感染病毒后的靶细胞(复制抑制组)进行相互作用,镜下观察各药物对HSV-1致细胞病变效应的抑制作用,并采用ELISA法测定感染48h后药物对HSV-1囊膜糖蛋白分泌的抑制作用.MTT法检测各药物对细胞的毒性作用.结果显示直接失活组中,HNP1,3可使HSV-1的致细胞病变效应减轻,对HSV-1直接失活的50%有效浓度(ECs0)为8.1μg/mL、10.03μg/mL;复制抑制组中,ACV使HSV-1的致细胞病变效应减轻,EC5o为0.68μg/mL.MTT检测结果表明HNP1,3在治疗浓度范围内无明显细胞毒性.以上结果表明HNP1,3除具有较强的抗菌作用和抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)活性外,还能失活HSV-1病毒颗粒,从而逆转病毒及其蛋白的病毒效应(致细胞病变)和抑制病毒蛋白质的合成.     

石上柏乙酸乙酯萃取物对喉癌Hep-2细胞增殖与迁移作用的研究

本文利用三种不同极性溶剂从石上柏中分离出活性成分,观察其对喉癌Hep-2细胞的增殖与迁移作用的影响。干燥的石上柏全草粉碎后经乙醇回流提取浓缩得浸膏,依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯三种溶剂进行萃取,以获得各极性溶剂萃取部位;MTT法检测石上柏提取物对Hep-2细胞增殖的影响;流式细胞仪检测石上柏提取物对Hep-2细胞周期的影响;细胞划痕实验检测石上柏提取物对Hep-2细胞迁移能力的影响;采用p53报告基因探讨石上柏提取物对喉癌Hep-2细胞的作用机制。结果显示31.2~500.0μg/m L的乙酸乙酯萃取部位能明显抑制Hep-2细胞的生长及划痕区域的迁移;15.0~60.0μg/mL的乙酸乙酯萃取物部位能使喉癌Hep-2细胞阻滞于G1期,并且能激活p53的表达。结果表明石上柏乙酸乙酯萃取部位可明显抑制喉癌Hep-2细胞的生长及迁移,其作用与激活p53通路有关。     

甘草甜素抗单纯疱疹病毒I的实验研究

目的旨在观察甘草甜素对HSV-1的抑制作用,为临床更为有效的治疗单纯疱疹病毒性脑炎探索新的药物。方法分体外及体内实验两个部分。体外培养Vero细胞,在病毒吸附Vero细胞后加入甘草甜素,观察空斑形成单位来评价甘草甜素对HSV-1的抑制作用;建立单纯疱疹病毒性脑炎小鼠模型,于小鼠腹腔内给药。通过观察实验组和对照组的小鼠死亡率来评价甘草甜素在体内对HSV-1的抑制作用。结果甘草甜素能明显抑制病毒所致的空斑形成,IC50为0．56mM;实验组小鼠的死亡率明显低于对照组。结论甘草甜素能明显的抑制单纯疱疹病毒I型的复制,能明显降低单纯疱疹病毒性脑炎小鼠的死亡率。     

甘草甜素抗单纯疱疹病毒Ⅰ的实验研究

目的 旨在观察甘草甜素对HSV-1的抑制作用,为临床更为有效的治疗单纯疱疹病毒性脑炎探索新的药物.方法 分体外及体内实验两个部分.体外培养Vero细胞,在病毒吸附Vero细胞后加入甘草甜素,观察空斑形成单位来评价甘草甜素对HSV-1的抑制作用;建立单纯疱疹病毒性脑炎小鼠模型,于小鼠腹腔内给药.通过观察实验组和对照组的小鼠死亡率来评价甘草甜素在体内对HSV-1的抑制作用.结果 甘草甜素能明显抑制病毒所致的空斑形成,IC50为0.56 mM;实验组小鼠的死亡率明显低于对照组.结论 甘草甜素能明显的抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型的复制,能明显降低单纯疱疹病毒性脑炎小鼠的死亡率.     

单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏、激活细胞模型建立

【目的】建立单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)潜伏感染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y及激活的细胞模型。【方法】分别加入20,40,60,80,100,120,140μmol/L的阿昔洛韦(ACV),观察对SH-SY5Y细胞生物性状的影响;在ACV存在的情况下,分别将含有0.1、1、10、100MOI的病毒液接种SH-SY5Y细胞,运用相差显微镜观察病毒对细胞的影响,确定潜伏的建立;分别用41℃、42℃、43℃、44℃、45℃加热0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h,观察加热时间及温度诱导HSV-2在SH-SY5Y细胞中激发的最适条件;加入25、50、75、100、125μmol/L福斯高林(Forskolin)诱导病毒在细胞中激活,探讨诱导的最佳浓度;对HSV-2在SH-SY5Y细胞中的潜伏及激发进行验证并测序;运用相差显微镜观察病毒激活后细胞形态的变化。【结果】60μmol/LACV的存在最适合HSV-2在SH-SY5Y细胞中建立潜伏状态;1-10MOI的感染量均能取得较好的病毒潜伏及激发效果;通过观察,病毒在SH-SY5Y细胞中最长可潜伏14d;43℃,1.5h及75μmol/LForskolin均为诱导病毒潜伏激发的最佳条件;相差显微镜观察病毒激发后细胞病变,从24h到72h,细胞变性、坏死的程度、数量随感染时间延长而增加;HSV-2LAT、gG基因PCR扩增及电泳结果,证实病毒在细胞中的潜伏及激活。【结论】初步在人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y上建立了HSV-2潜伏感染及激活的细胞模型,为下一步研究HSV-2的潜伏与激发机理,了解HSV-2的致病机制打下基础。     

缺氧诱导因子-1在病毒感染中的作用

缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一种由β亚单位和α亚单位组成的异二聚体转录因子,其表达产物参与细胞的许多生理过程。越来越多的研究提示HIF-1在病毒感染中发挥着重要作用。通过检索相关文献,对人病毒感染中HIF-1活性改变及其在病毒感染中的作用进行了综述,为研究HIF-1在病毒感染中的作用提供参考。     

Genetic variation of the VP1 gene of the virulent duck hepatitis A virus type 1 (DHAV-1) isolates in Shandong province of China

To investigate the relationship of the variation of virulence and the external capsid proteins of the pandemic duck hepatitis A virus type 1 (DHAV-1) isolates, the virulence, cross neutralization assays and the complete sequence of the virion protein 1 (VP1) gene of nine virulent DHAV-1 strains, which were isolated from infected ducklings with clinical symptoms in Shandong province of China in 2007–2008, were tested. The fifth generation duck embryo allantoic liquids of the 9 isolates were tested on 12-day-old duck embryos and on 7-day-old ducklings for the median embryonal lethal doses (ELD₅₀s) and the median lethal doses (LD₅₀s), respectively. The results showed that the ELD₅₀s of embryonic duck eggs of the 9 DHAV-1 isolates were between 1.9 × 10⁶/mL to 1.44 × 10⁷/mL, while the LD₅₀s were 2.39 × 10⁵/mL to 6.15 × 10⁶/mL. Cross-neutralization tests revealed that the 9 DHAV-1 isolates were completely neutralized by the standard serum and the hyperimmune sera against the 9 DHAV-1 isolates, respectively. Compared with other virulent, moderate virulent, attenuated vaccine and mild strains, the VP1 genes of the 9 strains shared 89.8%–99.7% similarity at the nucleotide level and 92.4%–99.6% at amino acid level with other DHAV-1 strains. There were three hypervariable regions at the C-terminus (aa 158–160, 180–193 and 205–219) and other variable points in VP1 protein, but which didn’t cause virulence of DHAV-1 change.     

共表达H5N1流感病毒M1和HA基因的DNA疫苗与腺病毒载体疫苗的小鼠免疫评价

为评价在小鼠体内表达流感病毒M1和HA基因诱导的免疫反应,制备共表达H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 全长基质蛋白1 (M1) 基因和血凝素 (HA) 基因的重组DNA疫苗pStar-M1/HA和重组腺病毒载体疫苗Ad-M1/HA,将其按初免-加强程序免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集小鼠血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集小鼠脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝     

Molecular Determinants Responsible for the Subcellular Localization of HSV-1 UL4 Protein

The function of the herpes simplex virus type 1 (HSV-1) UL4 protein is still elusive.Our objective is to investigate the subcellular transport mechanism of the UL4 protein.In this study,fluorescence microscopy was employed to investigate the subcellular localization of UL4 and characterize the transport mechanism in living cells.By constructing a series of deletion mutants fused with enhanced yellow fluorescent protein (EYFP),the nuclear export signals (NES) of UL4 were for the first time mapped to amino ac...     

Microarray multiplex assay for the simultaneous detection and discrimination of hepatitis B, hepatitis C, and human immunodeficiency type-1 viruses in human blood samples

Hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are transfusion-transmitted human pathogens that have a major impact on blood safety and public health worldwide. We developed a microarray multiplex assay for the simultaneous detection and discrimination of these three viruses. The microarray consists of 16 oligonucleotide probes, immobilized on a silylated glass slide. Amplicons from multiplex PCR were labeled with Cy-5 and hybridized to the microarray. The assay detected 1 International Unit (IU), 10 IU, 20 IU of HBV, HCV, and HIV-1, respectively, in a single multiplex reaction. The assay also detected and discriminated the presence of two or three of these viruses in a single sample. Our data represent a proof-of-concept for the possible use of highly sensitive multiplex microarray assay to screen and confirm the presence of these viruses in blood donors and patients.     

HTLV-1病毒蛋白Tax和HBZ协同促进成人T细胞白血病发生的机制

人类T细胞白血病1型病毒(Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)是与人类疾病发生密切相关的逆转录病毒。该病毒的感染可引起成人T细胞白血病(Adult T-cell leukemia,ATL)等多种疾病的发生。Tax和HBZ(HTLV-1 basic zipper protein)是由HTLV-1前病毒编码的两个关键病毒蛋白,它们被认为在HTLV-1病毒的复制、生存和致癌过程中发挥了至关重要的作用。本文就Tax和HBZ的蛋白结构以及它们在调控病毒转录、细胞生长和凋亡、病毒潜伏期,最终协同促进成人T细胞白血病发生过程中发挥的作用作一综述。     

H1亚型猪流感病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及其应用

为建立H1亚型猪流感病毒抗体检测方法,扩增了H1N1亚型猪流感病毒流行株的血凝素基因HA1部分,构建原核表达载体pET30a-HA1,并转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白。对重组蛋白包涵体进行变性、复性和Ni-NTA亲和层析纯化。以纯化后的蛋白作包被抗原,建立间接ELISA检测方法。利用该检测方法检测了2008?2009年采集的猪血清785份,阳性率为15.54％,不同省份的阳性率存在差异 (8％~47％)。以IDEXX相关试剂盒检测结果作为参照,该方法的诊断特异性达到91％,诊断敏感性达到95％。     

Specific Deposition of Passively Transferred Monoclonal Antibodies against Herpes Simplex Virus Type 1 in Rat Brain Infected with the Virus

The kinetics of human monoclonal antibody (anti-gB) to herpes simplex virus type 1 (HSV-1) were investigated after intravenous injection of anti-gB into an HSV-1 encephalitis animal model. Immunohistochemical study revealed specific deposition of passively tansferred anti-gB in the hippocampus and thalamus of the infected rat brain, and it bound to the same neurons in which HSV-1 antigen was positively stained. To examine the macroscopic distribution of anti-gB in the infected brain, we undertook an ¹²⁵I-labeled anti-gB injection study, and the same distribution of ¹²⁵I-labeled anti-gB deposition was observed by brain semimicroautoradiography as in the immunohistochemical study. These results suggest that anti-gB easily permeates the capillary wall and is deposited in the inflammatory site where HSV-1-specific antigen is detectable. The use of radioisotope-labeled anti-gB injection and external brain imaging could lead to a noninvasive diagnostic tool for the early detection of HSV-1 antigen in cases of suspected HSV-1 encephalitis.