聚苹果酸生产菌株出芽短梗霉菌代谢组学样品前处理方法的优化

为了得到更加准确和完整的胞内代谢物信息,从而更加真实的反映微生物胞内代谢情况,基于GC-MS平台,从淬灭剂、提取剂和溶解剂3个方面对代谢组学样品制备过程进行了系统性的优化。对比了不同淬灭剂对胞内代谢物的渗出及细胞损伤情况,结果表明60%甲醇/0.9%Na Cl效果最佳。研究了不同提取剂、溶解剂的提取和溶解效果,结果显示60%甲醇提取效果显著,吡啶溶解效果突出。最终确定了出芽短梗霉菌代谢组样品最适前处理方法 :预冷的60%甲醇/0.9%Na Cl淬灭细胞,液氮研磨和反复冻融破碎细胞,预冷的60%甲醇提取,最后采用吡啶溶解提取物并采用MSTFA 40℃衍生90 min。采用该方法可以检测出300多种代谢组分,包括大量氨基酸、有机酸和糖类物质。本方法可以有效的应用于出芽短梗霉菌代谢组学样品的研究。     

基于GC-MS的阿维链霉菌代谢物组学研究方法的建立

基于GC-MS分析平台,建立了阿维链霉菌代谢物组样品制备过程中的菌体分离、细胞清洗、细胞淬灭及代谢物提取条件,并对阿维菌素高产菌株和野生菌株胞内代谢物组进行了初步分析。采用"冷冻离心-细胞清洗(3次)-液氮淬灭(5min)-珠磨破壁(3个循环,每个循环48 s)-提取(氯仿∶乙醇∶水=2∶2∶1)"的方法,可以定性和定量检测阿维链霉菌胞内包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖类等59种差异化合物。建立的方法能够有效地用于阿维链霉菌胞内代谢物的分析。     

高山被孢霉淬灭方法及胞内代谢产物的气相色谱-质谱分析比较

在花生四烯酸生产菌高山被孢霉代谢组学研究中,需利用胞内代谢物的提取手段并基于气相色谱-质谱（GC-MS）分析方法对其进行检测。比较了3种胞内代谢物提取方法及不同色谱柱条件下GC-MS分析结果。研究表明：采用冷甲醇淬灭分别较液氮直接淬灭及真空过滤后,减少了胞内代谢物的泄露并更好地实现了胞外及胞内代谢物的分离。在对代谢物分析的比较中,极性色谱柱（DB-FFAP）检出的代谢物仅为11种,主要为有机酸、醛类;而代谢物经衍生化后采用非极性色谱柱（DB-5）共检出32种化合物,主要为糖、糖苷及醇类。     

CRISPR/dCas9在苜蓿中华根瘤菌中的建立与应用

本文探讨了CRISPR/dCas9系统对苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 320内源hemE基因的弱化效果,以提高其维生素B_(12)的能力。实验首先验证了CRISPR/dCas9系统及CRISPR/dCas9系统不同N20靶向位点在S.meliloti 320中对外源基因gfp的弱化效果。结果显示,当添加诱导剂1%木糖时,单位OD荧光值降低为对照菌株的34.18%,当N20靶位靠近翻译起始位点时,对结构基因弱化效果明显。进一步探究CRISPR/dCas9对S.meliloti 320中内源的弱化效果发现,在加入终浓度为1%木糖诱导后,hemE基因的转录水平与对照相比下降了28.3%。将hemE基因弱化后的工程菌进行摇瓶发酵,其维生素B_(12)产量较对照株提高了9.86%。研究结果显示,hemE基因的弱化有效促进了代谢流引向维生素B_(12)合成,CRISPR/dCas9系统对S.meliloti 320内源结构基因具有较好的弱化效果。     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)LuxR家族转录因子ExpR调节motC操纵子的表达

目前已知苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)Rm1021 ExpR 突变导致胞外多糖Ⅱ(EPSⅡ)的过量表达,而胞外多糖是根瘤菌成功侵染宿主植物形成有效根瘤必需的物质。软琼脂板实验发现ExpR 突变株运动能力有缺陷。但是鞭毛染色实验并没有检测到突变株的鞭毛与野生型有什么不同。通过启动子-lacZ融合子进一步研究突变株中基因表达的差异发现,ExpR以细胞密度依赖的方式调节motC操纵子的表达。由此可见,在苜蓿中华根瘤菌中,ExpR同时参与了胞外多糖Ⅱ的合成和细胞运动能力的调节。     

天蓝色链霉菌代谢物组测定方法优化及其代谢特征

链霉菌能够产生多种抗生素,具有重要的研究与应用价值。代谢物组学能够定性和定量测定胞内外主要低分子量代谢产物。相对于其他组学,代谢物组学在监控胞内代谢状态、指导物种理性改造方面具有独特优势。本文旨在建立一种快速、准确的链霉菌胞内代谢物分析方法。以模式菌株天蓝色链霉菌为研究对象,基于GC-MS分析平台优化了代谢物组学样品制备流程中的细胞淬灭时间、菌体分离方法、代谢物提取及代谢物衍生化条件,并利用该方法对天蓝色链霉菌不同生长时期各代谢途径的相对活性进行了初步分析。采用"低温淬灭(–40℃,4 min)-快速过滤分离-反复冻融(45 s/3 min)-衍生化(40℃,90 min)"的流程能够鉴定出中心代谢途径(糖酵解、戊糖磷酸途径和TCA循环)、氨基酸代谢途径、脂肪酸代谢途径、核酸代谢途径及部分次级代谢途径中的103种主要代谢物。利用该流程测定发现天蓝色链霉菌细胞生长周期中存在显著的代谢时序差异,并且发现氨基酸与脂肪酸代谢在衔接初级代谢与次级代谢生物合成中具有重要作用。本研究建立的测定方法能够有效地用于天蓝色链霉胞内代谢物分析,该方法将有助于深入刻画链霉菌细胞代谢过程,为菌株代谢工程改造增加次级代谢产物产量提供理性指导。     

苜蓿根瘤菌巨大质粒的观察与正确分子量的确定

采用在缓和条件下溶菌和蔗糖密度梯度离心等方法,分离出苜蓿根瘤菌(Rkizobium meliloti)菌株MV~2/1细胞内的全部DNA。用电子显微镜观察DNA部分时,可看到超卷曲的或呈松驰状态的完整巨大质粒和全部染色体。经测定DNA链的长度,利用经验公式正确地     

甲酸提取酿酒酵母中S-腺苷-甲硫氨酸工艺研究

目的:研究酿酒酵母细胞内S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)的提取工艺。方法:以酿酒酵母胞内SAM的提取率为指标,考察6种不同提取剂对SAM的提取效果,确定最佳提取剂;通过比较提取剂浓度、料液比、提取时间、提取温度等因素对SAM回收量的影响,确定最佳提取条件。结果:6种不同提取剂中,甲酸溶液对SAM的提取率最高,达到了85.6%;优选的提取剂浓度为1.2 mol/L、料液比为1:5 g/mL、提取温度为15℃、提取时间为2 h,SAM回收量达12.68mg/g。结论:甲酸提取酿酒酵母胞内SAM是一种提取SAM的新工艺,具有实际应用价值和工业应用前景。     

新疆豆科短命植物弯果胡卢巴根瘤与根瘤菌的特性

[目的]对弯果胡卢巴根瘤增殖特性、根瘤显微结构、根瘤菌遗传聚类以及根瘤菌各种抗性进行观察、分析和鉴定.[方法]分别利用不同基质培养、石蜡切片和树脂半超薄切片以及16S rRNA基因序列扩增和序列分析等技术方法对弯果胡卢巴根瘤和根瘤菌进行研究.[结果]①在混合土(养花土:白杨林下土:沙土=1:1:1)中有明显结瘤且植株结荚最多,多数根瘤呈掌状和姜形;②显微结构显示根瘤由表及里分为表层、皮层、维管束、已侵染细胞与未侵染细胞几部分;③对根瘤菌16S rRNA基因全长序列(1377bp)测序并分析,结果显示其与苜蓿中华根瘤菌16S rRNA基因的同源性达99.9%;④根瘤菌抗逆性鉴定结果显示,在温度为4℃～60℃(20 Min)、pH值为6.0～12.0、NaCl浓度为0%～2%的范围内根瘤菌均可正常生长;低浓度的卡那霉素、链霉素及头孢霉素等抗生素(25μg/mL,)就能完全抑制根瘤菌的生长,但仍能在100μg/mL的氨苄青霉素中正常生长.[结论]弯果胡卢巴结瘤需要较好的土壤及通气条件;根瘤簇生,瘤内含大量被根瘤菌侵染的细胞;弯果胡卢巴根瘤菌与苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti,)同源性最高,是一类较耐高温和强碱的菌株.     

草木樨属根瘤菌的16S rDNA-RFLP分析

采用16S rDNA-RFLP分析方法对草木樨属根瘤菌进行了遗传多样性及系统分类研究。结果表明,3种限制性内切酶(HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ)对所有供试菌株的酶切图谱类型组合只有2种。类型I的代表菌株CC-NWSX0003-1与豌豆根瘤菌(R.leguminosarum)的模式菌株USDA2370的序列相似性达到99.8%,在分类地位上属于根瘤菌属(Rhizobium)分支;类型Ⅱ的代表菌株CCNWGS0006与草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的16S rDNA相似性为100%,属于中华根瘤菌属(Sinorhizobium)分支。     

费氏中华根瘤菌042BS结瘤调节基因的克隆及功能检测

费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii) 0 4 2BS可以在大豆和苜蓿上结瘤。用费氏中华根瘤菌USDA2 5 7的nodD1和nodD2基因分别作为探针 ,与 0 4 2BS总DNA进行Southern杂交 ,发现其DNA经EcoRI酶切后分别在 3 0kb和 6 0kb处各有一条阳性带。回收这两条阳性带附近的DNA片段 ,建立部分基因文库 ,克隆到带有nodD1基因的 3 0kb片段 ,以及带有nodD2基因的 6 0kb片段。对nodD1和nodD2进行序列分析 ,结果表明 0 4 2BS的nodD1与费氏中华根瘤菌根瘤菌USDA2 5 7和USDA1 91的同源性高达 99% ,而nodD2与USDA2 5 7的同源性为1 0 0 %。再将nodD1的片段克隆到pBBRIMCS 5载体上 ,导入豌豆根瘤菌蚕豆生物变种 (Rhi zobiumleguminosarumbv.viciae)LPR5 0 5 4中进行功能检测 ,显示 0 4 2BS的nodD1均可被大豆分泌的类黄酮物质染料木黄酮以及苜蓿分泌的类黄酮物质毛地黄黄酮所诱导     

基于比较代谢组学的理性优化方法提高阿维菌素产量

【目的】利用比较代谢组学的分析方法,研究不同发酵培养基中阿维链霉菌的胞内代谢差异,揭示合成阿维菌素的关键代谢物和代谢途径,再通过理性优化添加主要关键代谢物,提高阿维菌素产量。【方法】对M1和M2培养基中生长的菌体进行基于GC-MS的胞内代谢组学分析,通过理性添加强化前体代谢物,确定阿维菌素高产培养基。【结果】GC-MS共检测到232种物质,能够精确匹配70种胞内代谢物,通过PCA和PLS分析,最终确定了21种已知的胞内代谢物与阿维菌素的生物合成密切相关。其中乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和油脂类物质对阿维菌素的产量影响较为显著。通过单独或组合优化添加这些前体,阿维菌素的产量从5.36 g/L提高到了5.92 g/L,增加了10.4%。【结论】基于比较代谢组学分析的理性优化培养基的方法可有效提高阿维菌素的产量,并为提高当下生物基产品的产量提供了新思路。     

苜蓿根瘤菌17560细胞膜膜脂组成分析及DGTS合成基因克隆与表达

【目的】分析一株分离自黑龙江省的苜蓿根瘤菌在低磷胁迫及正常磷含量条件下细胞膜脂的组成,并从该菌中克隆和鉴定细胞膜无磷脂二酰基甘油三甲基高丝氨酸(DGTS)合成基因。【方法】分别在不同磷含量的Sherwood基本培养基中进行根瘤菌培养,采用Bligh-Dyer方法提取细胞膜脂,以文献报道Sinorhizobium meliloti(苜蓿中华根瘤菌)菌株1021的脂类图谱和磷脂PE、PG、PC标准品作为参照,利用薄层层析方法分析不同磷含量条件下培养菌株的细胞膜脂组成。根据GenBank中已发表的DGTS合成基因btaA和btaB序列设计引物,以产DGTS菌株基因组DNA为模板,扩增btaA和btaB同源基因,并在E.coil BL21(DE3)表达。同时检测表达菌株是否合成细胞膜无磷脂DGTS以验证基因功能。对菌株17560进行16S rRNA基因序列分析。【结果】分离自黑龙江省的苜蓿根瘤菌17560与Sinorhizobium meliloti的16S rRNA基因序列相似性高达99.8%,但其细胞膜脂组成明显不同于参比菌株Sinorhizobium meliloti 1021的膜脂组成。在低磷胁迫条件下,该菌株的细胞膜脂主要由OL和DGTS等无磷脂组成,但OL的组成明显不同,该菌株含有3种不同类型的鸟氨酸脂(OLs),而参比菌株Sinorhizobium meliloti 1021只含有一种类型的鸟氨酸脂(OL)。在正常磷含量条件下,该菌株的细胞膜脂主要由PE和一种未知的含氨基磷脂组成,PG与PC的含量均较少,而参比菌株Sinorhizobium meliloti 1021的细胞膜脂主要由PE、PG与PC组成。通过PCR扩增从产DGTS菌株17560中获得1 913 bpDNA片段,经序列分析发现其中有两个ORF与菌株Sinorhizobium meliloti 1021的btaA和btaB基因序列相似性均为99%。将该DNA片段克隆于pET-30a(+)得到重组质粒pLH01,转化宿主菌获得表达菌株E.coli BL21(DE3).pLH01,经IPTG诱导后产生相对分子量约为45 kD和25 kD的蛋白。薄层层析验证重组菌细胞膜脂组成,结果表明,表达菌株E.coliBL21(DE3).pLH01可以在IPTG诱导后合成无磷脂DGTS,而转入空载体pET-30a(+)的阴性对照菌株E.coli BL21(DE3).pET-30a(+)则不能合成。【结论】系统发育地位相同的苜蓿根瘤菌株的细胞膜脂组成明显不同;苜蓿根瘤菌的细胞膜组成随培养基中的磷含量不同而变化,低磷胁迫条件下其细胞膜脂主要由OL和DGTS等无磷脂组成;在Sinorhizobium膜脂中首次发现一种未知的氨基磷脂及3种不同类型的鸟氨酸脂(OLs);从菌株17560中克隆获得2个DGTS合成基因btaA和btaB,在大肠杆菌中成功表达,并证实了所表达基因的功能。     

黑水虻抗菌肽HI-3对人结肠癌HCT-8细胞 谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路的影响

【目的】研究黑水虻Hermetia illucens抗菌肽HI-3对人结肠癌HCT-8细胞氨基酸代谢的影响,以丰富对其抑癌机理的认识。【方法】采用CCK-8法测定不同浓度(80, 160和320 μg/mL)抗菌肽HI-3对HCT-8细胞的抑制率;利用GC-MS进行HCT-8细胞代谢物测定,通过基于R软件的通路分析找出氨基酸含量差异最显著的氨基酸代谢通路并筛选出该通路靶标酶。320 μg/mL HI-3处理HCT-8细胞后,利用酶活性检测试剂盒测定靶标酶谷氨酰胺酶(GLS)活性;利用RT-qPCR和Western blot技术分别对HCT-8细胞的GLS基因进行mRNA及蛋白表达水平的测定;利用生化试剂盒和ELISA试剂盒检测HCT-8细胞内谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路涉及的重要代谢物谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、谷胱甘肽(GSH)、α-酮戊二酸(α-KG)和ATP含量的变化。【结果】浓度为80, 160和20 μg/mLHI-3对HCT-8细胞的抑制率分别为33.85%±3.50%, 46.26%±0.90%和55.53%±1.70%,且抑制率随HI 3浓度升高而增大。320 μg/mL HI-3处理对谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路的影响最大,其中氨基酸代谢物含量与阴性对照组(0 μg/mL HI-3)相比差异最为显著;这一通路中的靶标酶GLS活性及其GLS的mRNA和蛋白表达水平均极显著低于阴性对照组;另外与此通路相关的重要代谢物Gln, Glu, GSH, α-KG和ATP含量与阴性对照组相比亦显著减少。【结论】浓度为320 μg/mL黑水虻抗菌肽HI-3对HCT-8细胞谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路影响最为显著,并能通过阻碍该通路来显著抑制HCT-8细胞的增殖。     

高效液相色谱测定小蔓长春花中长春胺的方法优化

采用不同比例的甲醇-1%二乙胺(pH 7.5)、甲醇-1%碳酸铵、乙腈-1%二乙胺(pH 7.5)、乙腈-1%碳酸铵为流动相,在比对保留时间的基础上加以光谱确认,并对小蔓长春花提取液中长春胺保留时间及其分离情况进行研究,以选择测定长春胺的最佳流动相体系.结果显示:在甲醇-碳酸铵、乙腈-碳酸铵、乙腈-二乙胺体系中,长春胺峰很难完全分离,其光谱扫描结果与标准品不一致;而在甲醇-二乙胺体积比为65∶35时,长春胺峰可实现基线分离,其光谱扫描结果与标准品一致,且长春胺在0.05~0.5 g/L范围内与峰面积线性关系良好(R2=0.997),平均加样回收率为100.71%(n=5),RSD=2.23%.研究表明,甲醇-1%二乙胺(体积比为65∶35,pH 7.5)为测定小蔓长春花中长春胺含量的最佳流动相体系,可用于小蔓长春花药材的质量监控.     

甲醇周期诱导控制强化毕赤酵母生产猪α干扰素

利用甲醇营养型毕赤酵母生产猪α干扰素(pIFN-α),诱导过程一般在高细胞密度、定值控制甲醇浓度于5～10g/L下进行,此时、溶解氧浓度(DO)自然下降到接近于0的水平。如果高好氧的毕赤酵母长期处在高甲醇/低DO的诱导浓度环境会导致其代谢活性恶化,胞内甲醇积累严重,pIFN-α表达生产效率低。为此,提出了一种甲醇周期诱导控制策略来强化pIFN-α生产。先将甲醇控制于高浓度达7h,再降低甲醇流加速率,将DO控制在20%左右约4h,一共重复6个循环。采用上述周期控制策略,毕赤酵母代谢活性可以长期维持在较高水平;胞内甲醇处于极低水平(≤0. 003g/g DCW),解除了甲醇毒性效应; pIFN-α活性达到3. 90×10~7IU/ml的最高水平,是定值控制甲醇浓度时的1. 86倍。     

反相高效液相色谱法测定血清中γ-氨基丁酸

建立一种高灵敏度的氯甲酸芴甲酯柱前衍生荧光检测反相高效液相色谱法测定血清中γ-氨基丁酸的方法.内标为己氨酸, 固定相为Shim-Pack CLC-ODS(M), 4.6 mm×150 mm, 填充料为5μm; 流动相采用二元梯度洗脱, A相为0.05 mol/L醋酸钠缓冲液∶水∶四氢呋喃∶冰乙酸(250∶100∶15∶2.2), B相为乙腈∶甲醇(4∶1).系统研究了pH值、反应时间、离子强度及衍生化试剂用量对衍生化反应的影响, 确定最佳反应条件和最佳色谱条件.方法的精密度为批内变异系数＜4.6%,批间变异系数＜6.1%;最低检出限(信噪比＝2)为3.1 nmol/L;线性范围为50～1000 nmol/L, γ²＝0.9992;平均回收率为97.1%.     

利用HPLC建立对比筛选法测定红花中色素金橙Ⅱ

利用高效液相色谱法,分别检测并对比红花药材中羟基红花黄色素A和金橙Ⅱ的浓度,从而建立对比筛选红花样品中金橙Ⅱ的方法。结果在46个红花样品中,推测有26个可疑阳性样品;而通过对比筛选法能将可疑阳性样品数减至2个。经HPLC-MS法确证了对比筛选法的结果。检测羟基红花黄色素A(HSYA)的色谱条件为:甲醇-乙腈-0.01%磷酸溶液(体积比为26∶2∶72)为流动相。检测金橙Ⅱ的色谱条件为:乙腈-0.025 mol/L溶液(40∶60)为流动相。此法相比于常规只检测红花中金橙Ⅱ的方法,筛选效率与精确度更高,并且更经济、适应性更广。     

腈菌唑导致的细胞膜穿孔对斜纹夜蛾SL细胞膜通透性的影响

研究了腈菌唑导致的细胞膜穿孔对离体培养斜纹夜蛾Spodoptera litura卵巢细胞(SL细胞)膜通透性的影响。结果表明: 腈菌唑可使不能穿过SL细胞膜的大分子物质荧光染料PI大量穿过细胞膜进入胞内,20和40 μg/mL腈菌唑处理后12 h,SL细胞荧光强度增加率分别为11.95%和25.80%;处理后24 h,SL细胞荧光强度增加率分别为27.77%和57.49%。腈菌唑也可明显提高SL细胞内大分子物质乳酸脱氢酶的漏出率,20和40 μg/mL腈菌唑处理SL细胞24 h后,胞内乳酸脱氢酶漏出率分别为30.66%和43.93%;处理后48 h,漏出率分别为41.22%和57.91%。腈菌唑可以明显提高SL细胞胞内钙离子含量,20和40 μg/mL腈菌唑处理SL细胞24和48 h,胞内钙荧光强度与对照差异显著。处理后24 h,腈菌唑对SL细胞的LC₅₀值为35.84 μg/mL,明显高于典型细胞毒剂鱼藤酮的活性。当质量比为1∶1和2∶1时,腈菌唑与鱼藤酮联用对SL细胞处理后24 h的LC₅₀值为43.92和26.09 μg/mL,共毒系数分别为137.60和188.49,增效作用显著,随着腈菌唑的含量增加,增效作用增加。腈菌唑对SL细胞具有良好的抑制作用,可以打通限制物质穿透的细胞膜屏障,提高农药活性成分的有效利用率。     

pH对灵芝液态发酵代谢物及抗氧化活性的影响

已有研究报道灵芝栽培生长的最适pH在中性偏酸环境,在碱性范围的生长及代谢情况鲜见报道。本研究主要探究广泛pH对灵芝液态发酵代谢物及其抗氧化活性的影响。采用摇瓶液态培养后分析代谢物中灵芝三萜、胞内外多糖、菌丝体蛋白及抗氧化活性等指标,系统比较灵芝菌丝体在pH值2-11的生长和代谢情况。研究结果表明,灵芝菌丝体生长、合成灵芝三萜、胞内多糖、30E胞外多糖、菌丝体蛋白和菌丝体水解氨基酸的最适pH值分别为10、3、2、7、2和2。对应结果分别为17.13 g/L、33.86 mg/g、72.73 mg/g、7.86 g/L、71.42 mg/g和107.10 mg/g。比对照分别提高28.5%、77.3%、22.4%、96.5%、97.1%和70.8%。胞内多糖组分1和组分2最高分子量均在初始pH 4,分别为1.016×10⁸ g/mol和9.280×10⁴ g/mol,胞外多糖组分1最高分子量在初始pH 10,为4.946×10⁶ g/mol;对菌丝体的总抗氧化能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力、羟自由基清除能力分析结果表明最佳的初始pH分别为3、7、9。本研究为液态发酵方式下灵芝生长及其代谢物定向调控发酵的工艺优化提供参考依据,同时发现灵芝菌丝体中优质蛋白及抗氧化活性可在功能性食品和化妆品领域推广应用。