丹参注射液对链霉素耳中毒豚鼠耳蜗iNOS表达的影响

目的: 探讨链霉素(SM)耳中毒过程中豚鼠耳蜗iNOS表达,以及丹参注射液(DS)的拮抗作用.方法: 应用光镜、电镜、免疫组化及图像分析技术,结合听性脑干反应(ABR)测试.结果: 用药10d后,SM组ABR阈值明显升高,DS SM组ABR阈值明显低于SM组,差异显著(P<0.01).光镜及电镜下可见SM组柯蒂氏器、内外毛细胞、螺旋神经节细胞、血管纹损伤严重,DS SM组损伤较轻.SM组iNOS在柯蒂氏器、内外毛细胞、螺旋神经节、血管纹的表达明显高于DS SM组.结论: SM耳中毒时ABR阈值升高,iNOS表达增强.DS能有效的降低SM所致的ABR阈值升高,并抑制iNOS的过量表达,从而减轻SM的耳毒性损伤,提示DS对SM耳毒性损伤有保护作用.     

线粒体毒素诱导突发性耳聋模型血管纹损伤机制的研究

目的研究线粒体毒素诱导豚鼠突发性耳聋模型血管纹损伤的机制。方法20只杂色豚鼠随机分为3-硝基丙酸（3-NP）组和磷酸盐缓冲液（PBS）对照组,分别经圆窗膜给予0.3 mmol/L 3-NP或PBS 10min。分别检测两组豚鼠的听性脑干反应测听（ABR）,血管纹丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及边缘细胞超微结构变化。结果与PBS对照组相比较,3-NP组ABR阈移增大、幅值减小;血管纹MDA含量增高（P〈0.05）,SOD活性降低（P〈0.05）;边缘细胞超微结构改变,尤以线粒体肿胀,空泡变最为显著。结论线粒体毒素通过氧化应激反应损伤突发性耳聋豚鼠的血管纹。     

川芎嗪抗链霉素耳毒性作用及其对豚鼠耳蜗外毛细胞钾通道的影响

本文旨在研究川芎嗪（tetramethylpyrazine,TMP）拮抗链霉素耳毒性作用及其对豚鼠耳蜗外毛细胞K^＋通道的影响,探讨TMP拈抗链霉素耳毒性的离子通道机制。60只豚鼠随机分为6组,应用听觉脑干反应（auditory brainstem response,ABR）技术检测豚鼠ABR听阈,观测TMP的抗链霉素耳毒作用;并采用全细胞膜片钳技术观察TMP对耳蜗外毛细胞Ca^2＋敏感艮电流的影响。结果显示,TMP明显降低链霉素导致的豚鼠ABR听阈升高,提示TMP具有抗链霉素耳毒性作用;TMP能明显增大豚鼠耳蜗外毛细胞Ca^2＋敏感艮电流,并呈浓度依赖关系。结果提示,TMP通过增大艮通道电导而拮抗链霉素耳毒性作用。     

mTOR／STAT3信号通路在谷氨酸诱导的PC12细胞损伤中的作用

目的：研究谷氨酸（glutamate,GIu）诱导PCI2细胞损伤后mTOR／STAT3信号通路的表达情况及对细胞损伤的保护作用。方法：用不同浓度谷氨酸作用不同时间诱导PCI2细胞损伤,筛选出合适的浓度和作用时间后,将细胞分为3组进行下一步实验,分别为A组：正常对照组;B组：20mmol／L谷氨酸处理组;C组：20mmol／L谷氨酸＋800nmol／L雷帕霉素（rapamycin,RAPA）处理组。应用流式细胞术检测各组处理12h后细胞凋亡率,Westernblot观察各组处理1h、4h、8h、12h后,P-mTOR,P-STAT3蛋白表达情况。结果：（1）谷氨酸对PCI2细胞的生长抑制作用随作用时间和作用浓度的增加而增强。（2）C组凋亡率明显高于A组和B组。（3）Westernblot检测结果表明B组各时间点p-mTOR,P．STAT3表达均高于A、c组,并在4h时达到高峰。结论：细胞损伤激活了mTOR／STAT3信号通路,该通路的激活减少了细胞凋亡,对谷氨酸导致的神经细胞损伤具有保护作用,有助于神经损伤的修复。     

缺氧对椭圆囊毛细胞谷氨酸递质合成及释放的影响

摘要 目的：探讨缺氧对豚鼠前庭耳石器椭圆囊毛细胞内兴奋性神经递质谷氨酸的合成及释放的影响。方法：分离4周龄豚鼠双侧椭圆囊进行体外培养,分别置于常氧（21% O₂）和低氧（1% O₂）环境下处理30 min,利用Western blotting、酶活性检测等方法检测前庭外周感受器椭圆囊斑毛细胞中谷氨酰胺酶的活性和表达水平,评价谷氨酸合成变化情况;利用ELISA、免疫荧光等方法检测椭圆囊组织中谷氨酸含量和毛细胞内谷氨酸分布情况。结果：在给予缺氧处理后,豚鼠椭圆囊毛细胞中谷氨酸合成关键酶谷氨酰胺酶的表达、酶活性均未发生显著性变化（P>0.05）;ELISA结果提示,相较于对照组,低氧组椭圆囊组织中谷氨酸水平降低5.6%（对照组vs.缺氧组：15.86±2.19 vs.13.02±1.21,P<0.05）;免疫荧光结果提示,相较于对照组,低氧组椭圆囊毛细胞内的谷氨酸更加广泛的分布于毛细胞基底部,而在纤毛一侧分布较少。结论：在体外培养的椭圆囊组织中,低氧处理并未影响毛细胞谷氨酸的合成过程,但会显著增加毛细胞内兴奋性神经递质谷氨酸的释放。     

糖皮质激素对谷氨酸和GABA受体的电生理反应的快速调制作用

在大鼠下丘脑薄片和豚鼠腹腔神经节上,分别用玻璃微电极细胞外和细胞内记录方法,观察了１０＾６ｍｏｌ／Ｌ糖皮质激素（ＧＣ）对谷氨酸和ＧＡＢＡ受体分层效应的快速调制作用。结果表明,ＧＣ灌流后５ｍｉｎ,对谷氨酸受体介导的效应起抑制作用,而对ＧＡＢＡ受体介导的效应起增强作用。撤除ＧＣ后,神经元对谷氨酸和ＧＡＢＡ的反应恢复到对照水平。低钙高镁灌流液不能取消ＧＣ的调制作用。结果提示,ＧＣ在不需要突触环路条件下,     

强噪声引起的ABRⅤ波振幅增大现象

为研究噪声作用后听觉中枢诱发反应振幅变化,用豚鼠记录了器材怕作用前后皮层诱发反应（ACER）和脑干诱发反应（ABR）的振幅和潜伏期,比较了暴露噪声前后短声刺激系列强度中ACER和ABR最大振幅和潜伏期,110dBA宽带噪声作用30分钟后,听阈提高53dB,ACER最大振幅增大24%,1小时后仍为24%,2小时后增大28%,峰间潜伏期（P1-P2）比暴露前缩短,噪声作用后ABRV波最大振幅增大15%,1小时后为21%,2小时后为28%,潜伏期比暴露前缩短,AP、ABP、Ⅰ、Ⅲ。Ⅳ波最大振幅均经暴露前减小。结果表明,强噪声作用后ACER存在振幅增大,同时ABRV波也有振幅增大现象。     

糖皮质激素对谷氨酸和DGABA受体的电生理反应的快速调制作用

在大鼠下丘脑薄片和豚鼠腹腔神经节上,分别用玻璃微电极细胞外和细胞内记录方法,观察了１０－６ｍｏｌ／Ｌ糖皮质激素（ＧＣ）对谷氨酸和ＧＡＢＡ受体介导效应的快速调制作用。结果表明,ＧＣ灌流后５ｍｉｎ,对谷氨酸受体介导的效应起抑制作用,而对ＧＡＢＡ受体介导的效应起增强作用。撤除ＧＣ后,神经元对谷氨酸和ＧＡＢＡ的反应恢复到对照水平。低钙高镁灌流液不能取消ＧＣ的调制作用。结果提示,ＧＣ在不需要突触环路条件下,可能通过非基因组途径影响谷氨酸和ＧＡＢＡ受体介导的效应。     

刺五加注射液对豚鼠庆大霉素耳毒性拮抗作用的实验研究

目的：探讨中药刺五加注射液（ASS）对庆大霉素（GM）耳毒性作用的影响及其机制。方法：豚鼠随机分成对照组、GM组、ASS4-GM组和ASS组。采用听性脑干反应（ABR）、透射电镜技术（TEM）、Western blot方法观察用药前后豚鼠的ABR阈值、形态学变化及caspase-3的表达情况。结果：用药后GM组ABR阈值明显升高;ASS组ABR阈值与对照组相比无显著性差异,与GM组和ASS4-GM组相比明显降低。透射电镜观察用药后GM组毛细胞损伤严重,出现了凋亡的形态学特征,而ASS4-GM组损伤较轻。Western blot结果表明用药后GM组豚鼠caspase-3表达明显增加;ASS4-GM组caspase-3的表达稍有升高。结论：刺五加注射液对庆大霉素耳毒性具有拮抗作用,其机制可能是通过抑制caspase-3的表达来实现的。     

活性氧在谷氨酸兴奋性神经毒性中的作用

活性氧在谷氨酸兴奋性神经毒性中的作用易永杨祥良徐辉碧（华中理工大学化学系,武汉４３００７４）关键词谷氨酸兴奋性毒性活性氧作为神经递质的谷氨酸贮存于神经末梢突触囊泡内,随神经冲动由钙内流介导释放到突触间隙,尔后作用于突触后膜的谷氨酸受体,在中枢神经系统...     

Hidden hearing loss is associated with loss of ribbon synapses of cochlea inner hair cells

The present study aimed to observe the changes in the cochlea ribbon synapses after repeated exposure to moderate-to-high intensity noise. Guinea pigs received 95 dB SPL white noise exposure 4 h a day for consecutive 7 days (we regarded it a medium-term and moderate-intensity noise, or MTMI noise). Animals were divided into four groups: Control, 1DPN (1-day post noise), 1WPN (1-week post noise), and 1MPN (1-month post noise). Auditory function analysis by auditory brainstem response (ABR) and compound action potential (CAP) recordings, as well as ribbon synapse morphological analyses by immunohistochemistry (Ctbp2 and PSD95 staining) were performed 1 day, 1 week, and 1 month after noise exposure. After MTMI noise exposure, the amplitudes of ABR I and III waves were suppressed. The CAP threshold was elevated, and CAP amplitude was reduced in the 1DPN group. No apparent changes in hair cell shape, arrangement, or number were observed, but the number of ribbon synapse was reduced. The 1WPN and 1MPN groups showed that part of ABR and CAP changes recovered, as well as the synapse number. The defects in cochlea auditory function and synapse changes were observed mainly in the high-frequency region. Together, repeated exposure in MTMI noise can cause hidden hearing loss (HHL), which is partially reversible after leaving the noise environment; and MTMI noise-induced HHL is associated with inner hair cell ribbon synapses.     

白噪声对听觉脑干电反应(ABR)和耳蜗电图(ECochG)的影响

本文通过20例听力正常人和10例听力正常豚鼠研究了白噪声对耳蜗电图(ECochG)和听觉脑干电反应(ABR)的干涉作用。实验结果表明,白噪声比短声(信号)的声强级低30dB(SL)以上时,ECochG和ABR的振幅仅轻微减小。白噪声与短声的声强级相等时,ECochG与ABR的振幅和出现率会明显受到干涉而减小,甚至完全消失。但是,此时的耳蜗微音器电位(CM)并未观察到有明显的变化。这意味着白噪声对ECochG和ABR的干涉作用主要与围绕毛细胞基底部的突触产生的抑制密切相关。由于白噪声对ABR各波的干涉有些差异,所以认为这种抑制,可能既包括脑中抑制也包括侧方抑制。     

一氧化氮对过氧化氢所致听力损失的保护作用

通过全耳蜗灌流法在体观察一氧化氮(N0)能否通过一氧化氮/环磷酸鸟苷(NO/cGMP)途径对抗过氧化氢这种氧自由基所致的听力损失。实验选用耳廓反射灵敏、无耳毒性药物使用史的健康杂色豚鼠(250-350 g)50只,雌雄不拘,随机分为5组,每组10只动物,分别行全耳蜗灌流人工外淋巴液;过氧化氢(H2O2);L-精氨酸(合成NO的底物);H2O2+L-精氨酸;H2O2+L-精氨酸+L-NNA(一氧化氮合成酶的抑制剂),均灌流2 h。通过圆窗龛电极,每隔30 min记录复合动作电位(compound action potential,CAP:由短声Click诱发)阈值,耳蜗微音器电位(cochlear microphonic,CM;由短纯音Tone Burst诱发)幅度,了解耳蜗功能的变化,并分离取出耳蜗基底膜并制备基底膜硬铺片,通过碘化毗啶(PI)和Hoecbst双染色方法,观察耳蜗组织各类细胞损伤情况。结果显示,灌流H2O2+L-精氨酸组的CAP阈移和CM下降幅度值明显低于单独灌流H2O2组,差异有显著性(氏P<0.05);前者形态学观察未见明显的细胞损伤,后者可见大量坏死红染的细胞。H2O1+L-精氨酸+L-NNA组CAP阈移和CM下降幅度与单独灌流H2O2组比较无统计学差异。实验结果提示NO可能通过NO/cGMP途径部分对抗过氧化氢所致的听力损失。     

豚鼠庆大霉素耳中毒后HSP70 mRNA的表达

为探讨热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70mRNA在庆大霉素(gentamicin,GM)耳中毒中的意义,本实验选用耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠(200~250g)20只,雌雄不拘,随机分成两组,每组10只。实验组动物每日腹腔注射GM100mg/kg;对照组动物每日腹腔注射与GM等量的生理盐水2.5ml/kg。两组动物混合饲养,均连续用药10d。在用药前1天和停药后第1天进行听脑干反应(auditorybrainstemresponse,ABR)测试。各组豚鼠在行第二次ABR检测后,应用原位杂交及图像分析技术观察GM耳中毒后HSP70mRNA在豚鼠耳蜗中表达。结果显示:实验组耳蜗ABR阈值明显高于对照组,有显著性差异(P<0.01);实验组豚鼠耳蜗血管纹、螺旋韧带、螺旋神经节细胞HSP70mRNA表达呈强阳性,其平均灰度值较正常对照组明显减小(P<0.001),即GM能显著增强耳蜗HSP70mRNA的表达。结果提示,GM中毒后,动物可能通过增加HSP70mRNA在耳蜗的表达,起保护听力的作用。     

噪声刺激后豚鼠耳蜗抗氧化能力的变化和α-硫辛酸对声损伤的保护作用

实验探讨了声刺激后豚鼠血清总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)和耳蜗组织一氧化氮(nitricoxide,NO)含量的变化及α-硫辛酸的抗氧化和对声损伤的保护作用。将豚鼠(350-400 g)随机分为无噪声对照组(n=20)、噪声+生理盐水组(n=20)和噪声+α-硫辛酸组(n=20)。噪声刺激(4.kHz倍频程,115 dB SPL 5 h)结束后立即测试脑于诱发电位(auditory brainstem responses,ABRs),取血清测TAC,制备耳蜗组织匀浆测NO的水平。所得结果如下:(1)无噪声对照组,动物听阈无明显变化;噪声刺激后生理盐水组,听阈上升的幅度明显高于α-硫辛酸组(P<0.05)。(2)噪声+生理盐水组,TAlC明显低于无噪声对照组(P<0.05);噪声+α-硫辛酸组同噪声+生理盐水组相比,TAC明显升高(P<0.05),同无噪声对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。(3)噪声+生理盐水组,NO含量高于无噪声对照组(P<0.05);噪声+α-硫辛酸组同噪声+生理盐水组相比,NO含量明显减少(P<0.05),同无噪声对照组相比,差异无显著性(P>0.05)。上述结果提示,噪声刺激后血清TAC降低,耳蜗组织内NO含量增加;α-硫辛酸可通过抗氧化机制对噪声性听力损伤(noise induced hearing loss,NIHL)发挥保护作用。     

Dynamic changes in hair cell stereocilia and cochlear transduction after noise exposure

The structures of cochlear transduction include stereocilia at the apical surface of hair cells and their connection to the tectorial membrane. The transduction site is one of the loci for noise-induced cochlear damage. Although stereocilia are susceptible to noise, it has been found that in the inner ears of avians, this fragile structure is largely self-repairing and is associated with recovery of hearing sensitivity after noise exposure, as observed in the difference between the temporal threshold shift (TTS) and the permanent threshold shift (PTS). In the mammalian cochleae, however, threshold shifts measured in the auditory brainstem responses (ABR) did not parallel the chronological changes in the stereocilia on hair cells. It is unclear how the morphological recovery of the stereocilia on the mammalian hair cells is correlated with the changes in cochlear transduction that can be assessed by measuring receptor potential. In the present study, guinea pigs were exposed to a broadband noise of 110 dB SPL for 2 h. Auditory sensitivity was evaluated using ABR and cochlear transduction was assessed using cochlear microphonics (CM). Stereocilia morphology was quantified at different time points after the noise and compared with the control. The noise produced a TTS of 55.69 ± 14.13 dB in frequency-averaged ABR thresholds. The threshold shift was reduced to 9.58 ± 11.75 dB SPL 1 month later with virtually no loss of hair cells. Damage to the stereocilia immediately after noise exposure was found to be associated with depression of CM amplitude. Virtually no abnormal stereocilia were observed 1 month after the noise in association with a fully recovered CM.     

Cav1.2在顺铂诱导C57BL/6J小鼠耳蜗螺旋神经元凋亡中的作用*

目的: 探究顺铂(CDDP)诱导C57BL/6J小鼠耳蜗螺旋神经元(SGNs)凋亡过程中Cav1.2的作用及其可能的机制。方法: 动物实验:选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为以下两组(10只/组):生理盐水组(Control组)和顺铂给药组(Cisplatin组)。Control组每天腹腔注射生理盐水,Cisplatin组每周期前4 d以3 mg/kg的剂量进行顺铂腹腔注射,后10 d每日注射生理盐水,重复三个周期。给药结束后,听性脑干反应(ABR) 检测小鼠听力阈值变化; 小鼠内眦采血,并断颈取耳蜗,超氧化物歧化酶(SOD)以及丙二醛(MDA)试剂盒检测血清及耳蜗组织的SOD活性和MDA含量;免疫印迹法(Western blot)检测耳蜗组织相关凋亡蛋白表达;苏木精-伊红HE染色观察小鼠耳蜗螺旋神经节形态学变化; TUNEL 染色观察小鼠耳蜗SGNs凋亡情况;免疫荧光观察耳蜗SGNs上Cav1.2的分布和表达。细胞实验:原代培养SGNs,根据CCK8选择顺铂5 μmol/L干预12 h并随机分为:对照组(Control)、溶剂组(DMSO)、Cav1.2阻断剂组(N)、顺铂组(Cisplatin)、顺铂与Cav1.2阻断剂共同孵育组(Cisplatin+N)。Western blot检测Cav1.2蛋白表达;Hoechst33342染色观察各组SGNs凋亡情况,流式细胞术检测各组SGNs凋亡率,Western blot检测相关凋亡蛋白的表达,CA²⁺探针检测细胞内钙离子浓度变化,线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测膜电位变化,线粒体超氧化物指示剂(MitoSOX^TM-red)检测线粒体释放ROS情况。结果: 动物实验:与Control组相比,Cisplatin组小鼠听力阈值升高(P<0.01), 血清及耳蜗组织MDA含量、耳蜗组织凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Bax 蛋白水平和TUNEL阳性率、Cav1.2蛋白表达水平等均明显升高(P<0.05, P<0.01);血清及耳蜗组织SOD活性、耳蜗组织抗凋亡蛋白 Bcl-2 蛋白水平和SGCs密度均明显降低(P<0.05,P<0.01)。细胞实验:与Control组相比,Cisplatin组的Cav1.2表达、细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平、细胞内钙离子浓度以及ROS释放均明显增加(P<0.05,P<0.01);而细胞的Bcl-2蛋白水平和线粒体膜电位则明显降低(P<0.01);Cav1.2阻断剂可部分逆转上述改变(P<0.05)。 结论: 顺铂可能通过上调Cav1.2促进钙内流,进而使线粒体ROS增多,引起SGNs氧化应激损伤从而诱导线粒体途径的细胞凋亡。     

6-Hydroxykynurenic acid and kynurenic acid differently antagonise AMPA and NMDA receptors in hippocampal neurones

6-Hydroxykynurenic acid (6-HKA), a derivative of kynurenic acid (KYNA) extracted from Ginkgo biloba leaves, was tested for its putative glutamate receptor (GluR) antagonism in comparison to the scaffold substance. The patch-clamp method together with fast-application techniques were used to estimate inhibition by 6-HKA and KYNA of agonist binding at NMDA and alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors (NMDARs and AMPARs) of CA1 pyramidal neurones. 6-Hydroxykynurenic acid proved to be a low-affinity antagonist. When comparing with KYNA, 6-HKA was less potent at NMDARs (IC(50) = 136 versus 59 microM), but showed a higher affinity to AMPARs (K(B) = 22 versus 172 microM). The replacement of 6-HKA and KYNA by glutamate was investigated on outside-out patches. Both antagonists competitively inhibited AMPAR responses and displayed fast unbinding kinetics, but the derivative was significantly slower displaced than KYNA (tau = 1.63 versus 1.22 ms). Our findings demonstrate that 6-hydroxylation considerably changes the pharmacological profile of KYNA. Among the 6-derivatives of KYNA, 6-HKA shows the highest affinity to AMPARS: Despite its relatively low lipophily, these properties might be of clinical relevance under conditions that compromise the integrity of the blood-brain barrier. Furthermore, 6-HKA should be a useful tool to analyse glutamate-mediated synaptic responses.     

卡那霉素耳慢性中毒对豚鼠耳蜗毛细胞中Bcl-2表达的影响

目的:探讨卡那霉素耳慢性中毒对豚鼠耳蜗毛细胞中Bcl-2表达的影响。方法:取20只豚鼠随机分为2组,实验组连续14d肌肉注射硫酸卡那霉素,200mg/(kg.d),对照组连续14d等量肌肉注射生理盐水,停药14d处死动物后制作耳蜗标本,处死前检测其ABR的变化,免疫组化及原位杂交法测定Bcl-2的表达。结果:豚鼠卡那霉素耳慢性中毒后,ABR阈值较对照组明显上升,Bcl-2阳性表达减低,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。结论:卡那霉素耳慢性损害可能与抑制Bcl-2的表达有关。