巴西橡胶树鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

鲨烯合酶(SQS )是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。以巴西橡胶树为试验材料,提取胶乳总 RNA,利用 RT-PCR 以及 RACE 的方法克隆橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区片段,并进行序列分析。结果表明：橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区为1239 bp,编码413个氨基酸,命名为 HbSQS 。荧光定量分析表明鲨烯合酶基因在不同组织里表达水平存在明显差异,且受乙烯调控。     

秦艽1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因(GmHDR)的克隆和表达分析

龙胆苦苷(gentiopicroside)等裂环烯醚萜苷类化合物是中药秦艽中主要的有效成分,属于萜类化合物的衍生物,1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase,HDR)是植物萜类物质合成的关键酶之一。该研究在实验室高通量测序的基础上,采用RT-PCR方法克隆了秦艽HDR基因(即Gm HDR基因),利用生物信息学的方法分析了Gm HDR编码氨基酸序列的理化性质、信号肽、转运肽、亚细胞定位、保守结构域和高级结构等特征,并采用实时定量PCR分析了HDR的表达模式。结果表明:秦艽Gm HDR基因包含一个完整的长1 392 bp的ORF框,编码463个氨基酸;Gm HDR与萝芙木、艾菊等植物HDR蛋白具有很高的一致性(≥84%),无跨膜结构域,有叶绿体转运肽等结构,主要定位于叶绿体中。实时定量PCR结果显示,Gm HDR基因在秦艽的花中进行表达量高,在叶、茎和根等部位表达较低。Gm HDR在序列上与其他植物的HDR蛋白序列特征上存在很大的相似性;Gm HDR基因主要在秦艽花中表达,可能主要参与花中萜类物质的合成。该研究结果可为今后研究秦艽环烯醚萜类化合物的生物合成机制提供依据。     

葡萄果实(E)-β-丁香烯合酶基因的克隆及其表达分析

利用生物信息学方法,通过电子克隆获得葡萄(Vitis vinifera Linn.) (E)-β-丁香烯合酶基因的cDNA序列;以从葡萄品种‘德引84-1’(‘Deyin 84-1’)果肉中提取的mRNA为cDNA模板,利用特异PCR技术克隆得到1个全长1 880 bp的基因,被命名为Vv-ECar(GenBank登录号JF808010),该基因序列包括开放阅读框1 674 bp、3’非翻译编码区209 bp和poly+ (A) 28 bp,可编码557个氨基酸.比对结果显示:葡萄Vv-ECar基因的核苷酸序列与葡萄VvGwECar2基因的同源性达93％,二者编码的氨基酸序列同源性达90.8％,均含有植物萜类合酶家族共有的保守域DDXXD;葡萄Vv-ECar与茶[Camellia sinensis (Linn.)0.Kuntze]和杨(Populus balsamifera subsp.trichocarpa×P.deltoids)的萜类合酶相关基因同源性均在73％以上;分子进化树的分析结果也显示葡萄Vv-ECar基因编码的氨基酸序列与其他植物的同源序列具有高度保守性.半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析结果显示:在葡萄果实发育的不同阶段均有Vv-ECar基因的表达,但其相对表达量随果实的发育呈先低后高的趋势,其中在幼果期相对表达量最高.     

茅苍术两个HMGR基因(AlHMGR)的克隆与分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是植物萜类化合物生物合成的关键酶,在茅苍术挥发油生物合成过程中起重要作用,但目前茅苍术AlHMGR全长序列尚不清楚。本研究在前期茅苍术转录组学研究的基础上,筛选AlHMGR序列,并进行其c DNA序列的全长克隆,然后分析AlHMGR的序列特征及其编码蛋白的结构特征。结果显示,所得两条AlHMGR全长cDNA序列分别为1 749 bp和1 770 bp,分别编码582个和589个氨基酸;系统进化分析表明与菊科植物朝鲜蓟亲缘关系最近。本研究还探讨了AlHMGR编码蛋白的氨基酸序列特征、蛋白结构特征及亚细胞定位。本研究结果为进一步阐明茅苍术萜类化合物生物合成和调控的分子机制提供了理论依据。     

滇牡丹1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)基因的克隆及功能分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS),作为MEP途径的第一个关键酶,在植物萜类合成中起着重要作用。为了克隆得到滇牡丹DXS基因,我们根据滇牡丹根皮转录组数据分析结果,首先获得滇牡丹DXS基因片段。之后根据获得的该片段设计特异引物,再利用RACE和RT-PCR技术从滇牡丹根皮中获得完整的DXS基因(Pd DXS)。Pd DXS基因全长为3 137 bp,全长基因中含有一个长度为2 151 bp的开放阅读框(ORF),该开放阅读框编码了717个氨基酸,根据开放阅读框序列推导所得蛋白序列绘制分子进化树,分子进化树将该基因推断所得蛋白与葡萄DXS蛋白聚为一类,因此,两者的DXS蛋白有较高相似性。经过氨基酸序列比对后,推断滇牡丹DXS具有叶绿体转运肽,二磷酸硫胺结合位点以及转酮醇酶结构域。半定量RT-PCR结果显示Pd DXS在根、茎、叶、花芽及花瓣中均有表达。本研究为确定滇牡丹中DXS的基因功能以及揭示滇牡丹中萜类化合物的生物合成提供了理论基础。     

牛樟芝HMGR基因的克隆和表达分析

为研究牛樟芝(Antrodia camphorata)萜类生物合成MVA途径中关键酶3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase,HMGR)的调控机制,从牛樟芝基因组中分离并克隆出AcHMGR基因,对其进行生物信息学分析、不同碳氮源添加物对该基因的诱导表达情况进行分析。分析显示:AcHMGR基因含7个外显子、6个内含子;开放阅读框为3 402 bp,编码1 133个氨基酸残基组成蛋白质序列;AcHMGR包含HMGR典型的多肽位点,即2个HMG-CoA结合基序:PLG(Ⅰ/Ⅴ)AGPLK(Ⅰ/Ⅴ)DG和AEGTLVASTSRG,2个NADP结合基序:TGDAMGMNMI和IEVGT(Ⅰ/Ⅴ)GGGT;分子系统进化分析显示,AcHMGR蛋白序列与其他多孔菌科真菌的HMGR聚为一支;表达谱分析显示:碳源中的果糖、氮源中的酪蛋白胨诱导表达AcHMGR基因的能力最强。本研究为探讨牛樟芝萜类,尤其是三萜类化合物的生物合成及调控机理提供了帮助。     

冬凌草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆与表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)是植物萜类代谢通路中2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径的第一个关键酶,在植物萜类物质的生物合成中发挥重要的作用.为了研究该基因在冬凌草二萜类成分合成中的作用,该研究在冬凌草转录组测序结果的基础上设计一对特异性引物,采用RT-PCR方法得到冬凌草IrDXS基因cDNA全长序列,并对其蛋白进行理化性质分析、信号肽预测、亚细胞定位预测、蛋白质二级结构、三级结构预测分析及跨膜域分析等生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR的方法检测IrDXS基因在冬凌草不同部位中的表达情况.结果表明:从冬凌草叶片中分离得到了一条编码DXS的全长基因,通过生物信息学软件分析发现,该基因编码全长2169 bp,编码722个氨基酸,分子量为77.7 kD.多序列比对发现该基因编码的蛋白和其他植物中已知的DXS蛋白序列具有较高的同源性,N端均包含了一段质体转运肽序列,并均具有一个保守的焦磷酸硫胺素结构域和与吡啶结合相关的DRAG结构域.序列进化树分析显示,IrDXS基因属于植物DXS2家族.DXS基因在冬凌草根中表达量最高、愈伤组织中最低.该研究首次获得了IrDXS基因的全长cDNA序列,并揭示了其在不同组织中的表达差异,为后续的深入研究IrDXS基因在冬凌草二萜类成分合成途径中的功能奠定了基础.     

茶树甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因CsMVD的克隆与表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以茶树品种‘福鼎大白茶’的芽叶为供试材料,采用RT-PCR技术,克隆茶树萜类化合物合成途径中的限速酶——甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶全长cDNA序列,命名为CsMVD(GenBank登录号为MF772780);该基因全长1 585bp,其ORF为1 266bp,编码421个氨基酸,蛋白质分子量46.45kD,理论等电点7.10。CsMVD蛋白可能定位于细胞质中,具有MVD1superfamily的保守结构域,不存在跨膜结构和信号肽,具有多个磷酸化位点,部分保守的氨基酸残基决定了蛋白的催化反应特异性和活性。系统进化分析表明,CsMVD与新疆紫草(Arnebia euchroma)MVD的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,CsMVD在茶树不同组织中均有表达,果实中CsMVD的表达量最高,表达水平表现为:果实茎根叶花;在白茶萎凋过程中,CsMVD基因的表达量在48h结束阶段显著高于0h,推测该基因与茶叶萜类香气化合物形成有关。     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

马铃薯萜类合酶基因StHcS的功能鉴定

为了研究马铃薯萜类代谢物的生物合成机制,从马铃薯基因组数据中筛选到一个萜类合酶基因。通过RT-PCR方法,从致病疫霉侵染后的马铃薯品种‘费乌瑞它’中成功克隆到该基因,命名为StHcS,并对其进行生物信息学分析、生化功能鉴定及表达模式分析。结果表明:(1)序列分析显示StHcS编码区序列长1 497 bp,编码498个氨基酸,分子质量为74.78 kD。(2)StHcS基因编码的蛋白序列含有DDXXD催化功能域,与短柱茶(Camellia maliflora)中的四甲基环癸二烯甲醇合酶相似度最高。(3)蛋白体外催化实验和大肠杆菌代谢工程分析表明,StHcS可以催化生成倍半萜化合物四甲基环癸二烯甲醇(hedycaryol)。(4)基因表达分析显示,StHcS可以被致病疫霉侵染诱导表达反式法尼烯焦磷酸(FPP),且在侵染后72 h表达最高;GC-MS分析显示,在受侵染的马铃薯块茎中检测到四甲基环癸二烯甲醇。StHcS生化功能的鉴定为倍半萜合酶的研究提供了多样性,也是首次在马铃薯中发现的四甲基环癸二烯甲醇合酶,为马铃薯萜类代谢途径解析提供了参考。     

川西獐牙菜SmDL7H基因原核表达及组织表达

该研究根据川西獐牙菜转录组信息获得7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的全长cDNA序列,对该基因进行同源克隆、生物信息学分析,并构建原核表达载体、转化大肠杆菌、进行原核表达和组织特异性表达分析,以探讨川西獐牙菜裂环烯醚萜合成途径中关键酶7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的功能,为研究裂环烯醚萜类化合物合成途径奠定基础。结果表明:(1)成功克隆了川西獐牙菜SmDL7 H基因(GenBank登录号为MH243070);SmDL7 H基因开放阅读框为1 554bp,编码517个氨基酸,相对分子质量为59.5kD,等电点9.02;生物信息学预测SmDL7 H基因编码蛋白无信号肽。(2)多序列比对及进化树分析显示,SmDL7 H编码的蛋白与滇龙胆、长春花、金银花等植物的DL7 H基因编码的蛋白具有较高相似性。(3)将SmDL7 H基因连接到pET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用0.1mol/L IPTG于25℃诱导12h,原核表达分析发现在59.5kD处有目的蛋白出现,表明与之前预测的蛋白大小一致。(4)荧光定量PCR分析显示,SmDL7 H基因在川西獐牙菜叶、茎、花、根、愈伤组织中均有表达,其中在叶片中表达量最高,在根中表达量最低。     

小鼠睾丸特异表达基因TSEG-1的克隆及序列分析

从表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)数据库ZooDDD中获得小鼠正常睾丸表达的EST, 通过dbEST数据库检索出与其高度同源的EST序列, 构建EST叠加群(contigs), Biolign软件拼接, GeneScan软件预测contigs对应的基因组序列中的外显子、内含子; 针对开放阅读框设计引物序列, 采用RT-PCR从小鼠睾丸组织中克隆新基因的cDNA, 分析该基因在小鼠各脏器中的mRNA表达, 并对测序结果进行生物信息学分析。结果表明: 在小鼠X染色体的1 668~2 011 kb间克隆出一新基因TSEG-1, 全长为510 bp, 开放阅读框为336 bp, 编码111氨基酸, 分子量12.84258 kDa, 等电点11.4000。RT-PCR证实该基因开放阅读框正确, 在小鼠睾丸组织中特异性表达, 且与小鼠其他cDNA 无同源性, 获得GenBank 登录号EU079024。功能区分析发现TSEG-1蛋白可能为一种跨膜蛋白, 跨膜区位于第41~61氨基酸残基。TSEG-1基因与人类睾丸特异性组蛋白2a变异体基因有较高同源性, 在TSEG-1基因5′-端非编码侧翼预测发现存在1个启动子区域, 范围为680 bp。 TSEG-1蛋白可能有4个抗原性位点, 2个特异性蛋白激酶的磷酸化位点, 其亚细胞定位可能位于线粒体。小鼠睾丸特异性基因TSEG-1的克隆为进一步研究其生物学功能和表达调控奠定了基础。     

北美鹅掌楸LtuFPPS1基因克隆与组织表达分析

法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPPS)是植物萜类物质合成前体法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)的关键合成酶。为探究北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)萜类合成途径的分子机制,该文利用北美鹅掌楸转录组数据,通过设计特异性引物,采用RACE技术克隆得到LtuFPPS1基因的全长序列并进行生物信息学分析。结果表明:(1) LtuFPPS1基因全长1 460 bp,开放阅读框(ORF)长1 056 bp,编码351个氨基酸,蛋白质分子量为40 589.45 D,等电点为5.19,不稳定系数为43.50,归类为不稳定蛋白; LtuFPPS1基因所编码的蛋白不含信号肽,定位于线粒体,是一种不稳定亲水性蛋白,具有类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域,α-螺旋为其氨基酸序列的主要二级结构。(2)进化树和同源序列分析表明,北美鹅掌楸LtuFPPS1蛋白与乐昌含笑(Michelia chapensis)的FPPS蛋白的亲缘关系更近。(3)组织表达分析结果发现,LtuFPPS1基因在北美鹅掌楸雌蕊中的表达量最高,其高低顺序为雌蕊花芽茎雄蕊萼片叶片花瓣根,据此推测萜类代谢物在花器官中的合成相对较多。综上所述,LtuFPPS1基因为萜类合成酶基因,可为从分子生物学层面探究北美鹅掌楸萜类物质的合成提供一定的理论帮助。     

杜仲1-基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-二磷酸合酶基因cDNA全长克隆与序列分析

植物萜类生物合成MEP途径中1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-二磷酸合酶（HDS）催化ME-2,4cPP生成HMBPP。以杜仲叶片cDNA为模板,采用反转录RCR及RACE技术分离出HDS基因的cDNA全长克隆。测序及序列分析结果表明该基因全长2 786 bp,基因内部含有完整的开放阅读框,共编码743个氨基酸,推导的蛋白质分子量为82.25 kD,理论等电点为5.89,编码序列含有2个保守的结构域PSN和PSI以及3个绝对保守的半胱氨酸位点。系统进化树分析表明EuHDS蛋白与葡萄HDS蛋白的进化距离最为接近（0.049）,其次为番茄（0.052）和橡胶（0.052）。     

滇龙胆GrCMS基因的克隆与表达分析

2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶是赤藓糖磷酸酯(MEP)途径中的第三个催化酶。以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因GrCMS,并进行原核表达和组织特异性表达分析。序列分析显示,GrCMS基因(登录号KJ917164)开放阅读框(ORF)长933 bp,编码310氨基酸,推测分子量为34.23 kD,等电点为7.68。蛋白质序列分析显示,GrCMS无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,可能定位叶绿体;具有CMS保守结构域。进化分析结果表明,GrCMS蛋白与长春花CrCMS蛋白亲缘关系最近。原核表达结果表明,GrCMS与预期蛋白大小一致。定量PCR结果表明,GrCMS基因主要在叶中表达。结果为进一步研究该基因功能和龙胆苦苷生物合成途径奠定基础。     

草莓ξ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ξ-胡萝卜素脱氧酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸.序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性.系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近.原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达.用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草每的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞叶.     

苦荞查尔酮合成酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因（CHS）的全长DNA序列和cDNA开放阅读框（ORF)序列. 序列分析表明,苦荞CHS DNA序列（GU172165）全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区（HM852753）全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS. 生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列（GFGPG）、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点. 半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子＞叶＞茎＞花＞根＞成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性.     

枸杞L-半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析

以青海枸杞(Lycium barbarum L.)为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆枸杞L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)基因序列,命名为LbGLDH。LbGLDH基因全长为2 114bp,包含一个开放读码框1 767bp(编码588个氨基酸)、5′末端序列57bp、3′末端序列290bp。LbGLDH基因核苷酸序列与番茄、马铃薯、烟草GLDH基因具有88%~90%的一致性。LbGLDH编码氨基酸序列包含GLDH蛋白酶具备的FAD-binding-4和ALO结构域。qRT-PCR分析结果显示,在枸杞不同组织中LbGLDH基因的表达、抗坏血酸含量和GLDH活性变化趋势相同,表现为在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少。推测LbGLDH基因表达促进枸杞果实中抗环血酸含量的积累。     

草莓ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近。原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达。用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花红果粉红果白果青果叶。     

玉米异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆及其功能分析

以玉米嫩叶为材料,采用RT-PCR技术克隆了植物萜类物质前体生物合成过程最后一个关键酶--异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)基因的全长cDNA,命名为ZmlPI(GenBank登录号为AY738148),该基因cDNA全长为1 382 bp,包含1 104 bp的开放阅读框,编码367个氨基酸残基.颜色互补分析表明ZmlPI能推动工程菌XLI-Blue pTreZmlPI pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,证实ZmIPI具有典型的IPI基因的功能.