体外传代对版纳微型猪骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白表达的影响

目的通过分离扩增版纳微型猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)观察传代对慢病毒转染的绿色荧光蛋白(GFP)表达的影响。方法采集4月龄版纳微型猪的骨髓,在DMEM/F12培养液中分离间充质干细胞(MSCs),并根据其形态学、抗原标志表达和分化潜能给予鉴定。MSCs与GFP慢病毒载体共培养,荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测传代后MSCs GFP表达率的变化。标记后传代至1、2、3、4代细胞间比较用非参数检验。结果采用直接培养骨髓,可以分离到高表达CD13、CD29、CD90、CD105的MSCs,并可诱导分化为脂肪、骨和软骨细胞。MSCs与携带GFP的慢病毒载体共培养3天即可观察到GFP的表达,最佳转染复数(MOI)值为50,最佳共培养时间为6 d。传代后MSCs GFP表达率呈下降趋势[1代转染率(42.3±2.25)%、2代转染率(41.6±2.65)%、3代转染率(41.4±3.75)%和4代转染率(38.2±4.75)%],但传至4代GFP表达率的变化差异无统计学意义(P0.05)。结论采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液可以从版纳微型猪骨髓中分离到MSCs,GFP慢病毒转染是标记MSCs的有效方法,连续传代4代不会显著影响GFP的表达。     

脐带间充质干细胞与再生障碍性贫血

再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)是由于物理、化学、生物或不明因素作用使骨髓造血干细胞和骨髓微环境严重受损,造成骨髓造血功能降低或衰竭,以全血细胞减少为主要表现的一组综合征。间充质干细胞(MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中。不仅具有多向分化潜能,还有多种免疫调节作用。许多研究表明MSCs抑制同种异体效应T淋巴细胞增殖,还能下调T淋巴细胞表面的活化分子CD25、CD38、CD69的表达。MSCs对DCs的分化、成熟和活化具有抑制作用,改变DCs的细胞因子分泌,使成熟的DCl分泌TNF-a减少,DC2分泌IL-10增加,从而抑制T淋巴细胞增殖。MSCs能够抑制IL-2和IL-15介导的NK细胞增殖,使IL-2刺激NK细胞分泌的IFN-y减少。通过这些机制来干预再生障碍性贫血,同时研究发现MSCs免疫原性较低。尤其脐带MSC,因为其独特优势,目前已经成为干细胞干预治疗AA的研究热点。     

慢病毒介导神经生长因子过表达诱导脐带间充质干细胞向神经元样分化

目的探讨神经生长因子(NGF)过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞(UMSCs)对细胞分化的影响。方法分离培养UMSCs,流式细胞术鉴定后利用慢病毒载体感染细胞,使其过表达NGF,72h后,通过免疫荧光检测NGF和GFP的表达,Western blot检测NGF蛋白表达水平,ELISA法检测细胞上清液NGF的含量,qRT-PCR检测相关神经因子基因的表达。结果流式细胞术显示细胞表面CD105、CD90、CD73阳性而CD34、CD45、CD19和CD14阴性,鉴定为脐带间充质干细胞。慢病毒转染后细胞NGF和GFP阳性,细胞内NGF和培养液中b-NGF含量都显著性增加,NGF、nestin、GFAP、MAP2及tubulin等mRNA的表达显著性增加。结论神经生长因子过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞会促使细胞向神经元样细胞分化,可应用于后续研究。     

CXCR4慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的：构建趋化因子CXC亚族CXCR4的慢病毒表达载体并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达。方法：用逆转录PCR方法获取CXCR4基因编码区片段,将构建的慢病毒载体质粒pLVTHM-EGFP-CXCR4与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染293T细胞,包装生产慢病毒。用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSCs）,后采用Real time PCR检测CXCR4 mRNA、Western Blot方法检测蛋白质的表达。结果：PCR、酶切和测序结果表明成功的构建了CXCR4基因重组慢病毒载体。同时用该慢病毒载体转染MSCs后可有效地增加MSCs中CXCR4的表达。结论：成功构建了CXCR4的慢病毒表达载体并能在MSCs中表达,为进一步研究其在干细胞移植中的应用奠定基础。’     

胍丁胺通过AMPK途径诱导间充质干细胞的凋亡

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有强大的组织再生修复及免疫调节功能,广泛应用于损伤性和免疫相关性疾病的治疗,但其过早凋亡会降低临床疗效,且机制不明。研究发现,胍丁胺(agmatine, AGM)可通过抑制一氧化氮(nitric oxide, NO)生成发挥抗炎功能,对脓毒症小鼠具有保护效应。移植MSCs治疗脓毒症也是一种有效的治疗方式,但二者是否存在相互作用及AGM是否影响MSCs生存却未见报道。该研究旨在探讨AGM对MSCs生存的影响及其分子机制。研究MSCs之前,该研究通过检测细胞表面marker(CD29、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105)及三系分化(成脂、成骨、成软骨)对其进行了鉴定。为了深入探究AGM对MSCs的作用,使用流式细胞术检测AGM处理后MSCs的凋亡率(Annexin V)以及Western blot检测经AGM处理后MSCs的凋亡相关信号通路蛋白p-AMPK、p-mTOR、p-S6K1、Cl-Caspase3的表达水平。之后进一步添加AMPK siRNA检测AGM诱导MSCs凋亡的分子机制。结果显示, AGM在体外以剂量依赖性的方式,通过抑制mTOR信号通路诱导AMP活化蛋白激酶(AMPK)活化,导致凋亡相关蛋白表达上调,从而介导MSCs凋亡。而AMPK siRNA处理能明显恢复mTOR通路,并抑制AMPK活化,使凋亡相关蛋白表达降低,进而减弱AGM诱导的凋亡效应。该文揭示了AGM可通过AMPK途径诱导MSCs的凋亡。     

携带白介素-18基因的人脐带间充质干细胞的构建及其意义

目的：构建携带白介素-18（IL-18）基因人脐带间充质干细胞（hUMSCs）,为肿瘤靶向性基因治疗研究提供一种工具。方法：体外分离培养hUMSCs,流式细胞仪（FACS）检测hUMSCs 的细胞免疫表型。应用基因重组技术将表达IL-18 基因的慢病毒转染至hUMSCs,利用RT-PCR 及Western blot 法检测IL-18 的蛋白mRNA表达水平。结果：成功在体外分离和培养了hUMSCs,流式细胞仪检测结果显示hUMSCs 表达CD29、CD44 和CD105,而不表达CD34 和CD45, 符合hUMSCs 的表型。成功构建携带IL-18 基因的hUMSCs,RT-PCR 及Western blot法检测结果提示IL-18基因转染至hUMSCs并能稳定表达。结论：构建携带IL-18基因的hUMSCs并稳定表达IL-18,为肿瘤靶向性基因治疗实验性研究提供了一种新实验工具。     

携带白介素-18基因的人脐带间充质干细胞的构建及其意义(英文)

目的:构建携带白介素-18(IL-18)基因人脐带间充质干细胞(hUMSCs),为肿瘤靶向性基因治疗研究提供一种工具。方法:体外分离培养hUMSCs,流式细胞仪(FACS)检测hUMSCs的细胞免疫表型。应用基因重组技术将表达IL-18基因的慢病毒转染至hUMSCs,利用RT-PCR及Western blot法检测IL-18的蛋白及mRNA表达水平。结果:成功在体外分离和培养了hUMSCs,流式细胞仪检测结果显示hUMSCs表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD34和CD45,符合hUMSCs的表型。成功构建携带IL-18基因的hUMSCs,RT-PCR及Western blot法检测结果提示IL-18基因转染至hUMSCs并能稳定表达。结论:构建携带IL-18基因的hUMSCs并稳定表达IL-18,为肿瘤靶向性基因治疗实验性研究提供了一种新实验工具。     

人脐带血间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的:探讨并建立稳定可靠的人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCBMSCs)体外分离和培养方法.方法:采用密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞,利用MSC易黏附塑料贴壁生长的特性,分离MSC并进行体外扩增培养,观测其形态学特征,绘制不同代数hUCBMSC生长曲线,流式细胞技术检测细胞表面标志物CD29、CD34、CD105、HLA-DR等表达情况.结果:本法可成功、可靠地在体外自hUCB中分离培养出粘附细胞,该细胞在体外培养呈梭形或成纤维样,其指数生长倍增时问约为36h,其细胞表面表达β1整联蛋白CD29、CD105(endoglm),不表达造血细胞标志物CD34以及HLA-DR.结论:人脐带血中存在问充质干细胞,采用优化的实验方法可以提高培养成功率,稳定获得MSC并体外扩增培养.人脐带血可以作为获得间充质干细胞稳定充足的来源.     

gas6基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定

目的:制备携带生长停滞特异性基因6(gas6)的慢病毒,并构建和鉴定稳定表达生长停滞特异性蛋白6(GAS6)的小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)。方法:采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs,用流式细胞术检测MSCs标志分子;根据Gen Bank中小鼠gas6基因序列设计并合成上下游引物,以MSCs提取的m RNA制备的c DNA为模板扩增gas6基因片段,克隆入慢病毒表达载体,获得Lenti-gas6-GFP-zeocin质粒并测序鉴定;采用三质粒包装系统(穿梭质粒p Lenti-gas6-GZ、包装质粒p SPAX2和p MD2.G)包装慢病毒,并验证其表达目的基因情况;将浓缩的慢病毒离心感染第4代MSCs,用吉欧霉素(zeocin)筛选培养后获得稳定表达GAS6的MSCs,采用流式细胞术检测其阳性率以及表面标志分子表达情况。结果:构建了携带gas6基因的慢病毒,建立了gas6基因修饰的MSCs。结论:慢病毒载体可介导gas6基因在小鼠MSCs中过表达,且不会干扰MSCs的生物特性,为进一步研究gas6基因修饰的MSCs的治疗作用奠定了实验基础。     

小鼠间充质干细胞诱导分化成脂肪细胞miRNA表达的变化

目的：探讨小鼠间充质干细胞（MSCs）定向诱导分化成脂肪细胞微小RNA（miRNA）表达的变化,为进一步研究miRNA调控MSCs向脂肪细胞分化的分子机制奠定基础。方法：采用全骨髓体外分离结合差速贴壁法纯化扩增C57BL／6小鼠MSCs,形态学观察细胞生长情况,并用免疫组化方法鉴定细胞表面抗原CD29、CIM4和CD34的表达。脂肪细胞分化诱导剂诱导MSCs分化为脂肪细胞,利用油红O染色,判断MSCs成脂分化情况。运用rrfiRNA芯片技术检测MSC8和脂肪细胞中差异表达的miRNA。结果：①倒置显微镜下观察,传5代后可获得均一性较高的MSCs;免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性。MSCs经脂肪诱导剂诱导后,胞内大量脂滴形成,油红O染色阳性;②基因微阵列分析表明,小鼠MSCs分化成脂肪细胞差异表达的miRNA共75个,其中20个表达上调、55个表达下调。结论：MSCs分化成脂肪细胞存在miRNA表达的变化,某些miRNA很可能具有重要的调控MSCs成脂分化的作用。     

GDNF慢病毒载体感染食蟹猴骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是基因工程和细胞治疗的种子细胞之一,本研究利用含胶质源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体感染成年食蟹猴MSCs,探讨转染后GDNF在MSCs中的体外表达水平及其影响因素。首先,通过密度梯度离心法分离食蟹猴骨髓单核细胞(marrow mononuclear cells,MNCs),体外培养食蟹猴MSCs。同时构建表达GDNF的慢病毒载体,并感染食蟹猴MSCs,分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法,测定感染不同拷贝数病毒和不同转染组细胞GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验结果显示,表达GDNF基因的慢病毒载体成功转染成年食蟹MSCs,体外培养的MSCs持续表达分泌GDNF。感染慢病毒的拷贝数可以影响GDNF分泌水平,相同条件下感染拷贝数越高,GDNF分泌量越多,其基因表达水平越高。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞的免疫细胞化学研究

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)分离、纯化和体外诱导分化为脂肪细胞。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养、定期换液,分离纯化出生大鼠MSC,传代扩增,并用免疫细胞化学法鉴定大鼠MSC的表面抗原。含地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和胰岛素的培养液诱导MSC分化后,油红O染色鉴定。结果 大鼠MSC体外扩增10代以上,稳定表达CD44、CD54、CD106。油红O染色显示诱导后,71.2％有脂滴积聚。结论 从大鼠骨髓分离、纯化、体外诱导培养MSC,可定向分化为脂肪细胞表型。     

问充质干细胞体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化

研究间充质干细胞(MSC)能否在体外调控造血.体外分离培养人骨髓来源的MSC,RT-PCR检测其造血生长因子的表达,并以其为饲养层细胞,接种骨髓单个核细胞(MNC),观察生长情况,并通过形态学观察和流式细胞术分析,鉴定细胞来源和分化方向.结果显示,MSC构成性表达SCF、Flt3L和M-CSF,不表达G-CSF和GM-CSF,在骨髓MNC和MSC共培养体系中,大约2周左右可以看到大量的圆形细胞粘附在梭型MSC上生长,细胞胞体为圆形,胞浆较丰富,胞核为圆形、半月型或肾型,部分细胞呈典型的单核细胞形态,流式细胞术分析该类细胞表达CD14,不表达CD15、CD41、glycophorin A、CD5和CD19.表明不需要添加外源性造血生长因子,间充质干细胞能在体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化,其定向分化可能与MSC分泌造血生长因子及MSC与造血细胞间相互作用有关.     

混合培养体系中间充质干细胞与造血干细胞生物学特性

为了体外同时获得符合鉴定标准的造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSC/HPC)和间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),本研究采用Ficoll淋巴细胞分离液方法从脐带血中分离出脐带血单个核细胞,MACS免疫磁珠法分离出CD34~+的造血干细胞。分离出的细胞与MSC同时接种在培养瓶中,利用15%AB型脐血浆的IMDM培养基添加白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)、IL-6、血小板生成素(thrombopoietin,TPO)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)和Flt-3配体(FMSlike tyrosine kinase 3 ligand,Flt-3L)因子培养体系来同时培养扩增HSC/HPC和MSC。为了评估扩增出的HSC/HPC和MSC是否符合细胞鉴定标准,本研究通过倒置显微镜观察HSC/HPC和MSC生长状态,并计数细胞。流式细胞仪检测HSC/HPC表面抗原CD34阳性百分率,检测第4代(P4)MSC表面抗原CD105、CD90、CD73、CD45、CD34和HLA-DR阳性表达率。半固体集落培养检测HSC/HPC的粒细胞-巨噬细胞集落形成能力。将共培养至P4的MSC行成骨、成软骨、成脂肪诱导鉴定。通过秋水仙素法进行MSC核型分析。结果显示,体外共培养的HSC/HPC依然有高增殖能力、集落形成能力和CD34阳性百分率。MSC具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞诱导分化的能力。MSC染色体核型维持稳定。以上结果提示本研究成功建立了一种合适的MSC和HSC/HPC混合培养体系,通过该体系可同时获得两种干细胞,共培养后的MSC依然有典型的MSC的生物学功能;共培养后的HSC/HPC的粒细胞-巨噬细胞集落培养、细胞数量和流式表型符合鉴定标准,HSC/HPC生物学功能没有受到影响。     

脐血CD-34单个核细胞来源间充质干细胞研究

目的 :探讨分离培养脐血CD-3 4 细胞来源间充质干细胞 (MSC)及研究其生物学特征。方法 :取足月妊娠健康产妇胎儿脐血 ,分离其中单个核细胞 (MNC) ,去除CD 3 4 细胞 ,体外用低糖型DMEM培养基培养。观察细胞形态、测定生长曲线、利用流式细胞仪对培养细胞进行表型测定、细胞周期分析、体外诱导分化实验以及检测造血因子的表达情况。结果 :脐血CD-3 4 细胞中可培养出间充质干细胞 ,可诱导向成骨和脂肪细胞分化并表达IL 6、SCF和SDF 1等造血生长因子。结论 :从足月妊娠健康产妇脐血CD-3 4 细胞可分离培养出间充质干细胞 ,具有与其它来源MSC类似的表型及分化潜能 ,在体外传代可保持其低分化状态并表达造血因子 ,可作为组织工程的种子细胞和具有促进造血作用     

体外缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡发生的机制研究

目的:研究体外大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs)。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V/PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中蛋白的变化。结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功。②对照组(无缺血缺氧)与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K(Phosphoinosi-tide-3kinase)/Akt(ProteinkinaseB,PKB)信号通路被激活(P<0.05);同时缺血缺氧组与缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组比较,缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少提示PI3K/Akt信号通路被抑制(P<0.05)。结论:PI3K/Akt信号通路对体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞凋亡发生有关键性作用。     

丙二醛对体外培养下小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的诱导作用

为了探索丙二醛对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)凋亡的诱导作用及其机制,在不同浓度的丙二醛培养体系中孵育MSCs 24 h,用TUNEL法、流式细胞术检测MSC凋亡率,并用实时定量RT-PCR、Western印迹检测Bcl-2、Bax及Caspase-3基因的表达水平。结果发现,MDA能浓度依赖性地增加TUNEL阳性细胞百分率、亚G1峰细胞百分率,同时下调Bcl-2 mRNA及蛋白的表达,上调Bax mRNA和Caspase-3 mRNA及蛋白的表达.这些结果表明:在体外培养条件下,丙二醛可诱导小鼠骨髓间充质干细胞的凋亡,其作用机制与Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表达水平的变化有关。     

人脐带间充质干细胞分离培养方法的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)体外分离培养的最佳方法。方法无菌条件下采集早产儿(不足37周)和足月儿的脐带,分离MSCs,比较胎龄、脐带新鲜程度、分离方法和不同培养基对脐带MSCs原代培养过程的影响,通过免疫荧光法检测脐带MSCs表面标记物的表达情况,观察脐带MSCs的生物学特性。结果足月分娩,新鲜脐带,采用组织块平铺法和MesencultTM培养基,脐带MSCs原代培养成功率较高。相同条件下,早产儿脐带MSCs原代培养成功率低于足月分娩脐带。人脐带MSCs高表达CD44、CD90和CD29。结论筛选出一种人脐带MSCs体外分离培养的最佳方法。     

间充质干细胞体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化

研究间充质干细胞(MSC)能否在体外调控造血。体外分离培养人骨髓来源的MSC,RT-PCR检测其造血生长因子的表达,并以其为饲养层细胞,接种骨髓单个核细胞(MNC),观察生长情况,并通过形态学观察和流式细胞术分析,鉴定细胞来源和分化方向。结果显示,MSC构成性表达SCF、Flt3L和M-CSF,不表达C-CSF和GM-CSF,在骨髓MNC和MSC共培养体系中,大约2周左右可以看到大量的圆形细胞粘附在梭型MSC上生长,细胞胞体为圆形,胞浆较丰富,胞核为圆形、半月型或肾型,部分细胞呈典型的单核细胞形态,流式细胞术分析该类细胞表达CDl4,不表达CDl5、CD41、glycophorin A、CD5和CDl9。表明不需要添加外源性造血生长因子,间充质干细胞能在体外调控骨髓造血前体细胞向单核系分化,其定向分化可能与MSC分泌造血生长因子及MSC与造血细胞间相互作用有关。     

脐带间充质干细胞——组织工程的新视角

目的 从脐带中分离培养脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC) 并进行鉴定,阐明其多向分化的潜在作用.方法 收集健康胎儿脐带,分离培养脐带中的间充质干细胞,以流式细胞仪对培养的间充质干细胞进行细胞表面标志检测,多种成分联合诱导其向脂肪、成骨方向分化,细胞化学染色检测诱导后的细胞变化.结果 脐带中分离培养的间充质干细胞不表达造血细胞系的标志CD34、CD45、HLA-DR,强表达CD105、CD44、CD90,在适当的诱导条件下可向脂肪及成骨方向分化.结论 脐带中存在具有多向分化潜能的间充质干细胞.