孟氏隐唇瓢虫细胞色素P450基因的克隆与序列分析

采用同源克隆和RACE技术,从孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemus montrouzieri Mulsant中克隆到细胞色素P450CYP9Z401基因的c DNA全序列(Gen Bank number:KP164813)。c DNA全长1722 bp,包含3'非编码区域(UTR)为86 bp和5'UTR为49 bp,开放阅读框(ORF)长1587 bp,编码528个氨基酸。预测的分子量为61.27 k D,理论等电点为6.58,无信号肽结构,在2-20氨基酸处存在跨膜螺旋。该基因拥有细胞色素P450特征序列螺旋C、螺旋K和Meander区域,另外还有血红素结合区(1个氨基酸差异)和螺旋I区(2个氨基酸差异)。与其他昆虫的CYP9家族基因比较,与赤拟谷盗Tribolium castaneum同源性最高,为47%,系统发育分析也表明两者的亲缘关系最近。CYP9Z401基因的克隆和比较分析为进一步深入研究孟氏隐唇瓢虫的细胞色素P450基因功能及其进化具有重要意义。     

孟氏隐唇瓢虫qRT-PCR分析中内参基因的筛选

选择合适的内参基因是qRT-PCR研究的关键。本文以孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemus montrouzieri Mulsant为研究材料,利用qRT-PCR技术,对孟氏隐唇瓢虫4个候选内参基因Actin、RPS23、GAPDH和β-tubulin的mRNA的表达量进行了分析,并用Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件分析它们在孟氏隐唇瓢虫不同发育阶段及成虫不同组织中的表达稳定性。结果表明,以成虫不同组织为材料时,综合三种软件分析结果显示4个候选基因表达稳定性平均等级值排名为RPS23(rank=1)β-tubulin(rank=2.3)GAPDH(rank=3)Actin(rank=3.7),以不同发育时期虫体为材料时,综合分析结果显示4个候选内参基因表达稳定性平均等级值排名为RPS23(rank=1.7)Actin(rank=2)GAPDH(rank=2.7)β-tubulin(rank=3.7)。综合分析在瓢虫不同发育阶段及成虫不同组织两种处理下,三种软件的评价效果,4个候选基因表达稳定性等级值的总平均排名为RPS23(rank=1.3)Actin(rank=2.8)=GAPDH(rank=2.8)β-tubulin(rank=3)。RPS23在瓢虫不同发育阶段及成虫不同组织中均显示出较高的表达稳定性及与其它基因之间极大的相关性,可以确定为孟氏隐唇虫不同发育阶段及成虫不同组织基因表达分析中一个稳定表达的基因,可作为单个内参基因或者其它内参基因的协同基因,本实验为开展孟氏隐唇瓢虫功能基因表达分析奠定了方法学基础。     

异色瓢虫气味结合蛋白基因HaxyOBP1和HaxyOBP6的克隆及表达谱分析

【目的】本研究旨在探索异色瓢虫Harmonia axyridis气味结合蛋白的结构和分布,更好地了解气味结合蛋白在异色瓢虫嗅觉系统中的作用。【方法】利用生物信息学方法克隆异色瓢虫2个气味结合蛋白基因序列并对其蛋白结构进行分析;通过实时荧光定量PCR分析克隆获得的这2个基因在异色瓢虫各个发育阶段和成虫不同组织中的表达水平。【结果】本研究成功克隆得到异色瓢虫两个气味结合蛋白基因HaxyOBP1和HaxyOBP6(GenBank登录号分别为MG757923和MG757927)。HaxyOBP1开放阅读框全长447 bp,编码148个氨基酸,具有6个保守的半胱氨酸,表明HaxyOBP1属于Classic OBPs。HaxyOBP1在异色瓢虫各发育阶段均有表达,在雄性成虫中表达量最高;组织表达谱分析表明HaxyOBP1在雄虫头部表达量最高。HaxyOBP6开放阅读框全长414 bp,编码137个氨基酸,具有4个保守的半胱氨酸,表明HaxyOBP6属于Minus-C OBPs。HaxyOBP6在成虫期的表达量明显高于幼虫阶段,并且在雄成虫中的表达量显著高于雌成虫;组织表达谱分析表明HaxyOBP6在雄成虫头部和雌成虫翅中表达量最高。【结论】本研究克隆得到异色瓢虫两个气味结合蛋白基因,表达谱分析表明HaxyOBP1和HaxyOBP6分别在异色瓢虫成虫头和翅中具有较高的表达水平,说明气味结合蛋白基因可能在异色瓢虫非嗅觉组织中同样具有重要作用。本研究结果为深入研究异色瓢虫气味结合蛋白结构和功能奠定了基础。     

苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1的克隆及表达谱分析

有证据表明昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)与其嗅觉识别密切相关,起着运输外界脂溶性气味分子通过嗅觉感器淋巴液到达嗅觉受体的关键作用.为了更好地了解OBPs在苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus (Goeze)嗅觉识别中的作用,本研究首次克隆了苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1 (GenBank序列号GQ477022). 测序和序列分析结果表明,该基因开放阅读框长438 bp, 编码145个氨基酸,预测分子量为15.69 kDa,等电点为5.01,N-末端疏水区包含由18个氨基酸组成的信号肽.蛋白特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸残基.利用RT-PCR和Real-time PCR技术对Alin OBP1在苜蓿盲蝽成虫不同组织和各个发育阶段的表达水平进行了测定,结果显示Alin-OBP1几乎全部在触角中表达.不同发育阶段Alin-OBP1表达量不同,在5龄若虫和成虫阶段表达水平最高.结果提示Alin-OBP1可能在苜蓿盲蝽感受包括性信息素在内的外界化合物的过程中发挥着重要作用.     

孟氏隐唇瓢虫生殖系统结构和卵子发生的研究

【目的】孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemus montrouzieri Mulsant生殖系统结构和卵细胞发生将为昆虫的系统进化关系及瓢虫分类提供依据,同时可作为瓢虫人工饲料研究开发的参考。【方法】利用组织石蜡切片技术和光学显微镜,观察孟氏隐唇瓢虫生殖系统结构,以及自成虫羽化后不同发育阶段卵巢发育状况和成熟卵巢管卵子发生过程。【结果】孟氏隐唇瓢虫雄性生殖系统包括2对附腺、1对精巢、1对输精管、1对贮精囊、射精管、弯管和阳基。雌性生殖系统包括2片生殖板、生殖腔、受精囊、中输卵管、1对侧输卵管和1对卵巢。单侧卵巢管数量在11~14根之间,卵巢管端部延伸出细长的端丝。卵巢管属于端滋式,分为原卵区和生长区。滋养细胞分散且细胞核几乎充满整个细胞,未见合胞体。卵细胞稀疏地集中在原卵区下端,并且可见营养索向卵巢管顶端延伸。根据卵细胞位置和形态,卵黄积累情况,滤泡细胞形态变化,将卵细胞发生分为前期,中期,中后期和后期。卵细胞发育后期,营养索消失,滤泡细胞排列疏松,细胞间隙增大。【结论】孟氏隐唇瓢虫卵巢管的滋养细胞是端滋式卵巢管滋养细胞中的原始类型,且推测瓢虫科昆虫卵巢管滋养细胞均属于此类。卵细胞早期发育过程中,卵细胞通过营养索从滋养细胞获取营养物质。     

孟氏隐唇瓢虫和台毛艳瓢虫对茶椰圆蚧的捕食作用

本首次报道,孟氏隐唇瓢虫和志艳瓢虫是茶椰圆蚧的重要捕食性天敌。1998－1999年我们研究了这两种瓢虫的生活习性及其对茶椰圆蚧二龄若虫的捕食作用。这两种瓢虫成6虫对共椰圆蚧二龄若虫的功能反应均可用HollingⅡ型模型模拟。孟氏隐唇瓢虫的模型参数为：α'=1.1302,Th=0.0093,maxNa=107.6233;台毛艳主虫的模型参数为：α'=1.0005,Th=0.0126,maxNa=79.3741。温度对孟氏隐唇瓢虫捕食作用的影响大于对台毛艳瓢虫的影响,个体间相互干扰对捕食作用的影响,孟氏隐唇瓢虫大于台毛艳瓢虫孟氏隐唇瓢虫干扰反应模拟模型参数为：Q＝0.4045,m=0.4359;台毛艳瓢虫干扰反应模拟模型参数为：0.3335m=0.4042。     

意大利蝗存储蛋白Hex2基因的克隆与表达分析(英文)

【目的】昆虫存储蛋白(hexamerin)是在昆虫体内独立发生普遍存在的一种特异性淋巴蛋白,在昆虫的生长发育过程中起重要作用。【方法】克隆意大利蝗Calliptamus italicus的存储蛋白Hex2基因,并利用qRT-PCR方法分析其在不同组织和不同发育阶段的表达模式。【结果】克隆到意大利蝗存储蛋白Hex2基因Cit Hex2,其cDNA全序列长2 610 bp,开放阅读框(ORF)长为2 022 bp,3'非翻译区(UTR)长为124 bp,碱基序列与其他蝗虫的Hex2基因核苷酸一致性为80%~84%。Cit Hex2编码673个氨基酸,预测分子量和等电点分别为78.7 k Da和6.01。氨基酸分析表明,Cit Hex2富含较高的芳香族氨基酸,其中苯丙氨酸和酪氨酸共占15.8%。定量分析结果表明,Cit Hex2在意大利蝗的整个发育阶段都有表达,且在每个龄期的蜕皮前后均有表达量的变化;在检测的所有组织中,雌性个体的表达量较高。【结论】Cit Hex2参与意大利蝗的发育过程,与其生殖有关。     

异色瓢虫多巴脱羧酶基因序列及低温诱导表达分析

多巴脱羧酶(dopa decarboxylase,DDC)是把多巴降解成多巴胺的重要酶类,在昆虫行为和发育中具有重要作用。本研究在转录组获得异色瓢虫Harmonia axyridis DDC基因序列的基础上,从ORF两端设计特异性引物进行扩增并测序验证,获得了DDC基因的c DNA的ORF全长序列,其包含1431 bp,编码476个氨基酸,软件分析预测显示该基因编码蛋白的分子量为53.88 k Da,理论等电点为5.80。本实验分为升温、降温、低温储存以及不同发育阶段(包括预蛹,1-3 d蛹,1-3 d 4龄幼虫以及羽化1-3 d成虫)4个处理组,采用荧光定量PCR技术研究异色瓢虫不同处理组DDC基因的表达水平。结果表明:DDC基因在蛹期第1天的表达量最高,在升温诱导条件下表达无差异,降温诱导下表达量上升;黄色雌成虫低温储存条件下基因表达量先显著上升后显著下降,黑色雌成虫表达量无差异,表明DDC基因可以在低温胁迫下高表达促使异色瓢虫适应环境变化。     

梨小食心虫Minus-C气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta的Minus-C气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并测定其在成虫不同组织中的表达量及其重组蛋白对气味配体的结合能力,推测其嗅觉生理功能。【方法】基于梨小食心虫雌虫触角转录组测序数据,利用RT-PCR克隆MinusC OBP基因的完整编码区;qPCR测定该基因在成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅]中的表达量;构建原核表达系统表达重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯度;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白与35种气味配体的结合能力。【结果】成功克隆了梨小食心虫的一个Minus-C OBP基因,命名为GmolOBP14(GenBank登录号:MF066361)。GmolOBP14开放阅读框长411 bp,编码136个氨基酸,成熟蛋白具有4个保守的半胱氨酸残基,属于Minus-C OBP亚家族。GmolOBP14在雌雄成虫的不同组织中均有表达,但在雄成虫翅和雌成虫触角中的表达量显著高于同性别的其他组织。重组蛋白GmolOBP14与气味配体的结合谱较窄,仅能与16种配体表现出不同程度的结合活性,其中与梨酯和十二醛的结合能力较强,解离常数Ki分别为6.92和12.74μmol/L;与癸醛、十四醛、顺-3-己烯-1-醇、苯甲醇和己酸丁酯有中等程度的结合活性,Ki分别为25.54,20.61,24.35,23.44和23.33μmol/L;GmolOBP14对性信息素组分没有结合活性,提示该蛋白不参与对性信息素的感受和识别。【结论】根据GmolOBP14基因的组织表达特点及其重组蛋白的结合特性,推测GmolOBP14除具有选择性结合和运输寄主植物挥发物的作用外,还参与与嗅觉无关的生理过程。     

二化螟Minus-C气味结合蛋白的分子克隆及功能鉴定

气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在昆虫对寄主气味的感受中起重要作用, 但有关Minus-C OBP及其功能的报道很少。本研究通过基因组数据分析并利用RACE技术, 克隆和鉴定了二化螟Chilo suppressalis (Walker)的一个Minus-C OBP基因, 命名为CsupOBP1（GenBank登录号： KC492498）。CsupOBP1基因的开放阅读框长423 bp, 编码141个氨基酸, 其中N端的18个氨基酸为预测的信号肽序列, 成熟蛋白序列中具有4个保守的半胱氨酸位点。实时定量PCR分析显示, 该基因在幼虫头部及成虫雌雄足、 翅和雄性触角等化感组织中高表达, 其中在雄虫触角内的表达量显著高于雌虫触角。利用荧光竞争结合实验对CsupOBP1重组蛋白与38种化合物的结合特性的测定表明, 重组CsupOBP1与β 紫罗兰酮的结合能力最强（Ki=9.53 μmol/L）。触角电位测定表明, 二化螟成虫可对β-紫罗兰酮产生显著的触角电生理反应, 但雄虫反应明显强于雌虫, 与结合试验及雄虫触角中CsupOBP1的表达量显著高于雌虫触角的测定结果相一致。鉴于β-紫罗兰酮是水稻等植物中普遍存在的一种芳香气味组分, 推测CsupOBP1可能通过对该气味的结合和运输, 从而在二化螟对寄主植物的嗅觉定向中起作用。     

利用套叠PCR技术进行基因突变和拼接

利用套叠PCR技术（又称重叠区扩增基因拼接法）对hGM-CSF基因内第28位氨基酸处的糖基化位点进行突变和进行人促性腺激素基因,腺苷酸激酶短肽与胰岛素样生长因子－基因三者之间的拼接,结果表明采用该技术能在体外实行有效的基因重组和定点突变,其成功率为100％,这一技术不需要内切酶消化和连接酶处理,技术操作员简单易行,在基因拼接,基因内部突变方面具有良好的应用价值。     

The life and death of gene families

One of the unique insights provided by the growing number of fully sequenced genomes is the pervasiveness of gene duplication and gene loss. Indeed, several metrics now suggest that rates of gene birth and death per gene are only 10–40% lower than nucleotide substitutions per site, and that per nucleotide, the consequent lineage‐specific expansion and contraction of gene families may play at least as large a role in adaptation as changes in orthologous sequences. While gene family evolution is pervasive, it may be especially important in our own evolution since it appears that the “revolving door” of gene duplication and loss has undergone multiple accelerations in the lineage leading to humans. In this paper, we review current understanding of gene family evolution including: methods for inferring copy number change, evidence for adaptive expansion and adaptive contraction of gene families, the origins of new families and deaths of previously established ones, and finally we conclude with a perspective on challenges and promising directions for future research.     

真核基因的快速克隆及表达

以细胞间隙连接蛋白基因Cx26作为目的基因,通过T-A载体介导,构建真核表达重组载体pcDNA3.1( ) /Cx26,重组表达载体转染人鼻咽癌细胞株HNE1,表达Cx26间隙连接蛋白。     

成簇基因的时空表达调控

成簇基因具有不同单个基因的特性,同一簇内基因大多有类似的结构,功能以及表达模式,基因之间时空表达模式及表达量高度协调,提示同一簇基因是作为统一整体进行调节的,具有共同的调节机制。基因成簇排列是实现基因时空协调表表达的基础,是遗传信息的一种高级组织形式,具有强大的进化优势,要揭示成簇基因表达调控的基本规律,应从顺式作用元件,反式作用因子,染色质等层次,进行整体的以及多基因相互作用的研究,这些机制的阐     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因,ｐｌ６基因为目的基因,将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游,构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６,并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

基因功能研究方法浅介

随着人类基因组计划的进展,数据库中积累了越来越多未知功能的基因序列,分析这些基因的功能将成为基因组计划的主要任务。本介绍了几种研究特定基因功能的方法及程序。     

运动能力相关基因的先天遗传与后天转移

对人体生理特性的研究结果显示,部分运动相关基因如α-肌动蛋白-3、血管紧张素I转换酶、Ⅱ型活化素受体B的基因多态性会明显影响运动员的运动天赋和体能。建立优秀运动员基因库,发现和鉴定可影响运动能力的基因变异体,使得在儿童中开展DNA测试,挑选适合某种特殊体育项目的运动天才和优化训练方法具有一定现实操作意义。另一方面,随着滥用基因技术以提高运动能力的可能性不断提高,部分基因有可能作为基因兴奋剂,通过基因转移的方法导入人体,其所涉及的伦理问题、对人类健康及社会的潜在危害等,已经引起了来自自然科学和社会科学不同领域的广泛关注。     

性别决定基因SRY的研究进展

SRY基因是哺乳动物性别决定过程中的主宰基因,其表达产物SRY蛋白是一种DNA结合蛋白,该蛋白含有一个HMG盒,能够以序列特异性结合到DNA双螺旋链的一侧,起到转录因子的作用。调节或协同下游基因如SOX9、AMH等基因的表达,使胚胎发育向雄性方向发展。     

BPOZ基因剔除小鼠模型的建立

BPOZ是在卵巢癌等肿瘤组织中表达下调的细胞生长抑制基因,建立BPOZ基因剔除小鼠模型,可以为在体研究BPOZ基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.运用生物信息学手段确定小鼠BPOZ基因组序列,设计基因剔除策略,构建完成了基因剔除载体XpPNT-BPOZ.以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得抵抗克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆.将同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的小鼠30只,其中15只为BPOZ基因剔除杂合子小鼠,阳性率为50%.在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠.初步的表型观察发现BPOZ基因剔除小鼠发育正常,有繁殖能力,进一步的表型分析工作正在进行之中.