抗菌肽LL-37及其衍生物对肝癌细胞HepG-2增殖和凋亡的影响效果比较

目的:比较抗菌肽LL-37及其衍生物对肝癌细胞HepG-2增殖和凋亡的影响。方法:以肝癌细胞HepG-2为靶细胞,采用不同浓度抗菌肽LL-37及其衍生物处理后,通过四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,流式细胞术Annexin V/PI双染色测定细胞的凋亡情况。结果:随着抗菌肽LL-37及其衍生物作用浓度的增加和作用时间的延长,其对肝癌细胞增殖的抑制作用逐渐增强,二者的浓度都达到300μg/m L时作用72 h,对肝癌细胞增殖的抑制作用最大(P0.01),且抗菌肽LL-37衍生物对肝癌细胞增殖的抑制率高于抗菌肽LL-37。流式检测结果显示:抗菌肽LL-37衍生物诱导的细胞凋亡率高于抗菌肽LL-37。结论:抗菌肽LL-37衍生物在抗肝癌细胞增殖和促进其凋亡方面的作用优于抗菌肽LL-37。     

内含肽介导PHB纯化人源抗菌肽LL-37体系的构建

新颖的内含肽介导PHB纯化蛋白体系,是一种高效表达、自动切割、纯化方便、费用低廉的蛋白表达纯化体系,有利于蛋白规模化纯化。本研究选用对原核细胞具有毒害作用的小肽--人源抗菌肽LL-37作为纯化对象,通过基因工程技术,构建内含肽介导PHB纯化人源抗菌肽LL-37体系,并利用该体系纯化LL-37。研究结果表明,本研究构建的内含肽介导PHB纯化人源抗菌肽LL-37体系可高效表达LL-37融合蛋白,利用构建的纯化体系能对目的蛋白进行纯化。     

人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的高效表达及其活性检测

根据GenBank CAA86115中的LL-37氨基酸序列, 选择毕赤酵母偏好密码子, 采用SOE方法合成了人源抗菌肽LL-37基因。所合成的LL-37基因全长为141 bp, 并在其N端引入kex2裂解位点, 以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZa-A质粒, 构建分泌型重组酵母表达载体pPICZa-A-LL-37。pPICZa-A-LL-37经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌LL-37于发酵上清液, 其表达量为206 mg/L。表达产物LL-37耐热性强, 在100℃条件下40 min内抗菌活性不变, 煮沸3 h以上仍具有活性。琼脂糖孔穴扩散法检测显示LL-37对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有很好的抑制活性, 其对金黄色葡萄球菌 CowanⅠ(Staphylococcus aureus)、致病性大肠杆菌K99(Enteropathogenic E.coli)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)分别为1.56 mg/mL、3.12 mg/mL和1.56 mg/mL。     

人LL-37与干扰素α2a密码子的优化及其在毕赤酵母中的融合表达

通过密码子优化,在毕赤酵母中高效表达人LL-37与IFN-α2a融合蛋白。先按P.pastoris密码子偏好性对LL-37与IFN-α2a的原始密码子进行了改造,并在二者之间加上Gly Gly Gly Gly Ser的柔性连接接头,人工合成设计的新序列,最后通过p PIC9K载体将其整合入P.pastoris GS115的基因组,构建出重组菌株GS115LI。利用遗传霉素浓度梯度筛选出两株高拷贝的GS115LI1和GS115LI2菌株。对这两株菌经发酵诱导后的发酵液进行SDS-PAGE检测、抗病毒活性检测和抗菌活性检测,证明重组株既能够成功表达出LL-37与IFN-α2a的融合蛋白,而且该融合蛋白成功保留了抗菌肽与干扰素的功能活性。诱导发酵后,融合蛋白的产量可达到819.1 mg/L,经盐析、疏水层析和离子交换层析分离,可得到纯度达97%的融合蛋白产物,回收率可达到46.2%,纯化后产品的效价可达2.6×108 IU/mg。经过密码子优化后,成功实现在毕赤酵母中高效表达出既有LL-37抗菌活性又具有干扰素α2a活性的融合蛋白。     

家蚕抗菌肽-死亡素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

近年来的研究发现,抗菌蛋白在生物体非专一性防御系统有着重要的作用,已有数十种具有抗菌活性的多肽被分离,这些多肽可大致分为3类,即含分子内二硫桥的抗菌肽;具有双亲a-螺旋结构的抗菌肽;以及富含某种氨基酸残基的抗菌肽[1],一般来说,这些抗菌肽具有分子量小,稳定性好,无细胞毒性,抗菌谱广等特点.多种抗菌肽的一级结构和二级结构已经确定[2],但作用机理仍不明了.一般认为可能存在两种作用模式,即1)通过肽-脂膜相关作用杀菌;2)通过受体介导的识别过程起作用[1].     

新疆家蚕抗菌肽基因突变及其抗菌活性的研究

为了改变抗菌肽的结构参数,探讨其结构与活性的关系,采用PCR扩增和人工合成基因的方法,对新疆家蚕抗菌肽基因进行改造及原核表达蛋白的抑菌活性研究.结果表明,α-螺旋、两亲性、疏水性、净正电荷数和关键氨基酸的替换等参数是相互依赖、相互影响,协同发挥作用,任何一个参数的改变都会影响抗菌肽整体的活性.α-螺旋是抗菌肽功能有效性的结构基础,但其所处的位置可能并不影响抗菌活性:两亲性结构是抗菌肽与生物膜相互作用的重要结构;疏水性程度必须保持在一定的范围内;在一定范围内增加多肽的阳离子能够增加抗菌活性,但正电荷数和抗菌活性之间无绝对正相关性;色氨酸的存在及抗菌肽的C-末端酰胺化能增强抗菌活性.     

人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的高效表达及其活性检测

根据GenBank CAA86115中的LL-37氨基酸序列,选择毕赤酵母偏好密码子,采用SOE 方法合成了人源抗菌肽LL-37基因.所合成的LL-37基因全长为141 bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗茵肽具有天然N端.基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-LL-37.pPICZα-A-LL-37经Sac Ⅰ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33.PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌LL-37于发酵上清液,其表达量为206mg/L.表达产物LL-37耐热性强,在100℃条件下40 min内抗茵活性不变,煮沸3 h以上仍具有活性.琼脂糖孔穴扩散法检测显示LL-37对多种革兰氏阴性茵和阳性菌均具有很好的抑制活性,其对金黄色葡萄球菌Cowan I (Staphylococcus aureus)、致病性大肠杆菌K99(Enteropathogenic E.coli)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)分别为1.56 μg/mL、3.12 μg/mL和1.56 μg/mL.     

家蚕抗菌肽-死亡素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

近年来的研究发现 ,抗菌蛋白在生物体非专一性防御系统有着重要的作用 ,已有数十种具有抗菌活性的多肽被分离 ,这些多肽可大致分为 3类 ,即含分子内二硫桥的抗菌肽 ;具有双亲α 螺旋结构的抗菌肽 ;以及富含某种氨基酸残基的抗菌肽[1 ] ,一般来说 ,这些抗菌肽具有分子量小 ,稳定性好 ,无细胞毒性 ,抗菌谱广等特点。多种抗菌肽的一级结构和二级结构已经确定[2 ] ,但作用机理仍不明了。一般认为可能存在两种作用模式 ,即 1)通过肽 脂膜相关作用杀菌 ;2 )通过受体介导的识别过程起作用[1 ] 。ＣｅｃｒｏｐｉｎＢ是一种较早从家蚕中分离得到 ,由 …     

α-螺旋型抗菌肽结构参数与功能活性的关系

随着耐药病原菌出现,寻求更为安全有效的新型抗菌制剂迫在眉睫。抗菌肽具有广谱抗菌活性,杀菌快,不易产生耐药性等优点,是理想的新型抗菌剂,具有广阔前景。α-螺旋型抗菌肽是抗菌肽中的一大类。本文从α-螺旋型抗菌肽螺旋度,疏水力矩,疏水性,净正电荷数等方面阐述了结构与功能关系,及构效关系在α-螺旋抗菌肽分子设计与改造中的应用。     

利用精氨酸和缬氨酸设计新型α-螺旋抗菌肽

摘要：【目的】抗菌肽是生命体的自身免疫系统的重要组成部分。其中两性的α-螺旋抗菌肽在抗菌肽家族中又占有重要的地位,发挥着重要的作用。为了得到具有更高抗菌活性同时具有很低细胞毒性的抗菌肽,根据α-螺旋二级结构衍生出来的螺旋轮模型,设计了一条在疏水一侧含有8个缬氨酸和亲水一侧含有5个精氨酸的新型16残基抗菌肽。【方法】测定了设计得到的新型抗菌肽的最小抑菌浓度、对于红细胞和哺乳动物肾细胞的细胞毒性以及杀菌动力学。 【结果】抗菌活性检测表明,新型抗菌肽VGR16显示了强并快速的杀菌作用,其最小抑菌浓度在16－64     

家蝇抗菌肽的研究与应用

近年来,对家蝇Muscadomestica体内外抗菌活性物质的研究受到人们广泛的关注,其中研究较多的是抗菌肽。家蝇抗菌肽对细菌、真菌、肿瘤癌细胞和病毒等具有生物活性,可通过针刺、带菌针刺、超声波、放射性射线、高频电磁场和生理盐水等方法诱导增量产生,能耐极端的温度和pH值的溶液,在高浓度盐溶液中也很稳定。文章还对家蝇抗菌肽的结构特点、作用机理与分子生物学研究做了概述,同时对家蝇抗菌肽的应用前景进行了讨论。     

抗菌肽结构改造与人工智能研发策略

抗菌肽是一类广泛存在于生物体内的小分子肽,参与构成生物体先天免疫,可以有效抵抗病原微生物的入侵。抗菌肽具有广谱抗菌活性,且不易产生耐药性等特点,在治疗感染性疾病方面具有独特的优势,有望成为理想的抗感染药物。然而,由于部分抗菌肽尚存在稳定性差、毒性高等问题,限制了抗菌肽的广泛应用。由于人工智能算法能有效合成具有高稳定性、低毒性的抗菌肽,在探索天然抗菌肽中展现了巨大的潜力,因此本文简述了抗菌肽的抗菌机制、结构改造以及利用机器学习和深度学习等人工智能算法进行新型抗菌肽研发的优化策略,以期为抗菌肽结构优化及研发提供新思路。     

利用ELP自断裂标签在大肠杆菌中生产抗菌肽Oxysterlin 1

抗菌肽是目前最有希望的抗生素替代品,但是使用重组技术生产抗菌肽的策略大多步骤烦琐且价格昂贵,不利于抗菌肽的规模化生产。Oxysterlin 1是一种新型的天蚕素抗菌肽,主要对革兰氏阴性菌有抗菌活性,具有较低的细胞毒性。文中利用一种简单经济的方法在大肠杆菌中实现Oxysterlin 1的表达和纯化。将Oxysterlin 1基因克隆到含有弹性蛋白样多肽Elastin-like polypeptide (ELP) 和蛋白质内含肽 (Intein) 的载体中,构建重组表达质粒pET-ELP-I-Oxysterlin 1。重组蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达,进而通过简单的盐析和pH改变便可对目标小肽进行纯化。最终得到的Oxysterlin 1的产量约为1.2 mg/L,抑菌试验显示出预期活性,为抗菌肽的规模化生产及深入研究其抑菌机理奠定基础。     

How to fight antimicrobial resistance

Antimicrobial misuse results in the development of resistance and superbugs. Over recent decades, resistance has been increasing despite continuing efforts to control it, resulting in increased mortality and cost. Many authorities have proposed local, regional and national guidelines to fight against this phenomenon, and the usefulness of these programmes has been evaluated. Multifaceted intervention seems to be the most efficient method to control antimicrobial resistance. Monitoring of bacterial resistance and antibiotic use is essential, and the methodology has now been homogenized. The implementation of guidelines and infection control measures does not control antimicrobial resistance and needs to be reinforced by associated measures. Educational programmes and rotation policies have not been evaluated sufficiently in the literature. Combination antimicrobial therapy is inefficient in controlling antimicrobial resistance.     

Novel short antimicrobial peptide isolated from Xenopus laevis skin

A rich source of bioactive peptides, including a large number of antimicrobial peptides, has been found in amphibian skin. In this study, a novel short antimicrobial peptide was purified from Xenopus laevis skin and characterised through reversed‐phase high‐performance liquid chromatography, Edman degradation and matrix‐assisted laser desorption/ionisation time‐of‐flight mass spectrometry. The peptide was composed of six amino acids with a sequence of DEDLDE and thus named X. laevis antibacterial peptide‐P2 (XLAsp‐P2). Transmission electron microscopy revealed that this peptide showed potential antimicrobial abilities against bacteria by damaging the bacterial cell membrane. XLAsp‐P2 maybe inhibit bacterial growth by binding to the microbial genomic DNA. The peptide also exhibited a weak haemolytic activity against rabbit red blood cells. Therefore, XLAsp‐P2 is a novel short anionic antibacterial peptide with broad activities. Copyright © 2017 European Peptide Society and John Wiley & Sons, Ltd.     

细菌耐药专刊序言

抗生素是人类对抗病原微生物感染的重要"武器"。然而,抗生素的大规模使用导致细菌耐药性不断增强并广泛传播。细菌耐药不仅是医学问题,同时也是社会和经济问题,涉及公共卫生、环境污染、食品安全等诸多领域。本专刊从临床耐药与流行病学、动物及环境耐药、细菌耐药机制、抗菌药物研发和耐药防控策略等角度对细菌耐药性问题进行了较系统的综述和探讨,为全面认识细菌耐药现状、深入开展耐药机制研究并制定综合防控策略等提供参考。     

Antimicrobial and antistaphylococcal biofilm activity from the sea urchin Paracentrotus lividus

Aims:  Staphylococcal biofilm-associated infections are resistant to conventional antibiotics. Consequently, new agents are needed to treat them. With this aim, we focused on the effector cells (coelomocytes) of the sea urchin Paracentrotus lividus immune system.
Methods and Results:  We tested the activity of the 5-kDa peptide fraction of the cytosol from coelomocytes (5-CC) against a group of Gram-positive, Gram-negative bacteria and fungi. We determined minimal inhibitory concentrations (MICs) ranging from 253·7 to 15·8 mg ml⁻¹. We observed an inhibitory activity and antibiofilm properties of 5-CC against staphylococcal biofilms of reference strains Staphylococcus epidermidis DSM 3269 and Staphylococcus aureus ATCC 29213. The antimicrobial efficacy of 5-CC against the biofilms of clinical strain Staph. epidermidis 1457 was also tested using live/dead staining in combination with confocal laser scanning microscopy. At a sub-MIC concentration (31·7 mg ml⁻¹) of 5-CC the formation of young (6-h old) and mature (24-h old) staphylococcal biofilms was inhibited.
Conclusions:  The biological activity of 5-CC could be attributed to three peptides belonging to the sequence segment 9–41 of a beta-thymosin of P. lividus .
Significance and Impact of the Study:  The effector cells of P. lividus represent an interesting source of marine invertebrates-derived antimicrobial agents in the development of new strategies to treat staphylococcal biofilms.     

Review: Water medication of growing pigs: sources of between-animal variability in systemic exposure to antimicrobials

On many Australian commercial pig farms, groups of growing pigs are mass-medicated through their drinking water with selected antimicrobials for short periods to manage herd health. However, delivery of medication in drinking water cannot be assumed to deliver an equal dose to all animals in a group. There is substantial between-animal variability in systemic exposure to an antimicrobial (i.e. the antimicrobial concentration in plasma), resulting in under-dosing or over-dosing of many pigs. Three sources of this between-animal variability during a water medication dosing event are differences in: (1) concentration of the active constituent of the antimicrobial product in water available to pigs at drinking appliances in each pen over time, (2) medicated water consumption patterns of pigs in each pen over time, and (3) pharmacokinetics (i.e. oral bioavailability, volume of distribution and clearance between pigs and within pigs over time). It is essential that factors operating on each farm that influence the range of systemic exposures of pigs to an antimicrobial are factored into antimicrobial administration regimens to reduce under-dosing and over-dosing.