广西巴马小型猪PGC-1α基因克隆与组织表达分析

目的克隆广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区（CDS）序列,利用RT-PCR和QRT-PCR方法分析PGC-1αmRNA组织表达情况。方法本实验以广西巴马小型猪背最长肌cDNA为模版,PCR扩增PGC-1α基因CDS序列,将其连接至pEASY-T5载体,转染细菌、验证和序列测定;通过RT-PCR半定量和QRT-PCR实时荧光定量检测PGC-1α基因在小型猪多个组织中的表达情况。结果克隆获得广西巴马小型猪PGC-1α基因CDS序列,全长2391 bp,编码796个氨基酸,与参考序列的同源性为99.9%,两处碱基发生同义突变,分别是C-A1105和GA1524;PGC-1α基因在广西巴马小型猪心脏和肾脏中的表达丰度最高,其次是肝脏、皮下脂肪和背最长肌,而在胰腺中未检测到其表达。结论成功克隆了广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究PGC-1α在小型猪2型糖尿病发生过程中作用途径打下基础。     

广西巴马小型猪Neuritin基因克隆与生物信息学分析及真核表达载体的构建

本研究旨在通过克隆广西巴马小型猪的Neuritin基因并进行生物信息学分析,为后续对Neuritin的研究奠定基础。实验成功获得Neuritin基因的编码区序列,并对Neuritin基因编码区序列和预测蛋白序列进行分析。结果表明,广西巴马小型猪的Neuritin基因编码142个氨基酸,其中含有2个磷酸化位点和2个跨膜信号结构以及1个结构保守域。通过双酶切技术成功获得重组质粒pEGFP-N1-Neuritin并转染到N2a细胞中,在24 h拍照发现N2a细胞发出荧光,证明Neuritin真核表达载体构建成功。     

广西巴马小型猪GK基因真核表达载体的构建及鉴定

GK基因在糖尿病的发生中具有重要功能,本研究旨在构建广西巴马小型猪GK基因真核表达载体,为生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定一定基础。以广西巴马小型猪肝脏组织为材料,通过RT-PCR的方法扩增并克隆猪GK基因的编码序列,并进行生物信息学分析,并将GK基因亚克隆至p EGFP-N1载体上,构建含有GK基因的真核表达载体p EGFP-N1-GK,经过PCR和双酶切的验证,通过脂质体转染,将重组质粒p EGFP-N1-GK转染猪的PK15细胞,48 h之后通过荧光显微镜观察细胞荧光蛋白的表达。研究结果表明广西巴马小型猪GK基因编码区序列长1 575 bp长的片段,共编码524个氨基酸,与Pubmed中查询到的猪(FJ436399.1)的GK基因同源最高,序列比对发现,在461 bp和534 bp处都发生了C-T的碱基突变,只有461 bp位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,成功构建p EGFP-N1-GK真核表达载体,并在PK15细胞中成功转录表达。为进一步研究葡萄糖激酶基因(GK)与糖尿病之间的关系,以及生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定基础。     

近交系小型猪线粒体基因组分析和家猪系统进化关系分析

广西巴马小型猪是长期近交培育而成的实验小型猪,遗传稳定.本研究拟通过线粒体基因组(mitochondrial DNA,mtDNA)分析来了解近交系的遗传背景,并从mtDNA角度进一步认识中国本土猪种的系统进化关系.实验设计29对特异性引物,PCR扩增和产物测序,拼接出广西巴马小型猪近交系7个世代猪的mtDNA序列;用42个品种猪的mtDNA D-loop区和基因编码区序列分布构建系统进化树.结果表明,广西巴马小型猪的mtDNA大小为16 761 bp,碱基组成、基因结构与其他猪种相似;近交系7个世代个体mtDNA发现有46个碱基差异位点,变异率为0.28％,mtDNA序列同源性在99.9％以上,表明该近交系母源单一;基于mtDNA序列构建的系统进化树不能清晰地区分地方品种猪之间的遗传关系.研究结果进一步表明广西巴马小型猪近交系的遗传背景单一,中国本土品种猪的母系关系复杂.     

陆川猪脂联素基因的克隆及生物信息学分析

脂联素(AdipoQ)是脂肪组织分泌的一种有活性的物质,其在调节脂肪代谢、脂肪沉积以及对抗胰岛素抵抗、炎症反应、动脉粥样硬化等方面发挥着重要的作用。本研究以Gen Bank家猪脂联素基因序列为参考,利用Oligo7自行设计一对引物,以广西陆川猪皮下脂肪组织cDNA为模板,克隆获得了AdipoQ基因编码区序列(CDS)。序列分析结果显示,陆川猪AdipoQ基因CDS区长为732 bp,可编码242个氨基酸,分子量为26 400.7 Da。信号肽预测显示陆川猪Adipo Q蛋白含有编码17个氨基酸的信号肽,这一预测结果也印证了前人的研究,进一步证实了脂联素为一种分泌蛋白的说法。与GenBank已公布的长白猪(DQ164208.1)、大白猪(DQ164207.1)、广西巴马小型猪(JF730719.1)、梅山猪(DQ164209.1)这四种猪AdipoQ基因CDS区进行序列比较,发现不同猪种间略有差异,而同源性均达98.9%以上。本研究还对克隆获得的陆川猪AdipoQ基因编码蛋白进行了高级结构预测,为后期研究AdipoQ基因调控陆川猪脂肪沉积和肌肉生长发育的分子机制提供理论基础。     

实验用西藏小型猪CYP3A基因的克隆及序列分析

目的:克隆西藏小型猪CYP3A基因并与人及其它小型猪品种进行序列比对分析。方法:根据Genebank数据库设计引物,取西藏小型猪新鲜肝脏组织,Trizol法提取肝脏总RNA,应用RT-PCR反转获得肝脏cDNA。分别扩增基因CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39,PCR片段回收后分别连接pMD-18T载体,获得重组质粒pT-CYP3A,阳性重组克隆送测序。采用NCBI Blast及vector NTI软件进行序列比对分析。结果:CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39基因编码序列全长1512 bp,编码503个氨基酸,与人CYP3A4相同。其中CYP3A22和CYP3A39与NCBI记录巴马小型猪序列相同;CYP3A46与巴马小型猪CYP3A46(NM_001134824.1)有6个位点碱基不同。CYP3A29与巴马小型猪CYP3A46(EU918131.1)亦有6个位点碱基不同。对来自2个母本后代猪的基因经过PCR扩增后测序发现CYP3A46、CYP3A29序列完全一致。结论:成功克隆西藏小型猪CYP3A的4个基因,其中CYP3A46与人CYP3A4的序列相似性最高。所得CYP3A46与CYP3A29序列可能为西藏小型猪独有。     

我国巴马小型猪SLA-2基因克隆及分子特征

为研究我国巴马小型猪SLA-Ⅰ分子特征,设计引物克隆了SLA-Ⅰ类分子SLA-2基因(SLA-2bm),并通过分子生物学软件分析其分子特征。经克隆及序列测定分析,SLA-2bm为1119bp,其中3~1097为ORF区,共编码364个氨基酸,分别在第125、188、227和283位置出现半胱氨酸残基,含有两对链内二硫键。氨基酸同源性分析显示SLA-2bm与其它SLA-2、SLA-3和SLA-1序列的同源率分别为88.4%~96.4%、88.3%~90.5%和87.7%~92.7%。系统进化树显示SLA-2bm与其它SLA-2等位基因在遗传关系上相对独立,进化程度较低;各功能区分析,SLA-2bm与人HLA-A2和小鼠H-2K分子结构相似,且保留了人HLA-A2基因的部分功能位点。结果表明,SLA-2bm属于一个新的等位基因,巴马小型猪是保留原始基因特征的品种。     

猪口蹄疫病毒受体通用亚基αv的基因克隆及序列分析

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的决定因素。研究发现,至少有四种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8是口蹄疫病毒(FMDV)的受体,其中αv是4种受体的通用亚基。首次从口蹄疫病毒实验感染猪的肺组织中克隆到了通用亚基αv基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪αv亚基基因的编码区含有3141个核苷酸,编码1046个氨基酸,其N-端30个氨基酸为信号肽,其后的胞外域、跨膜区、胞浆域分别由955、29、32个氨基酸组成;胞外域含有11个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)、2个Ca²⁺结合位点(DX［D/N］XDGXXD)、18个半胱氨酸残基。猪αv基因与牛、人、猕猴、家鼠、鸡、犬的αv基因的核苷酸序列同源性分别为93.3%、91.5%、91.4%、85.6%、73.2%、89.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.3%、94.6%、94.1%、90.8%、81.6%、93.8%,猪与牛αv亚基同源性最高,表明受体αv亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。     

广西巴马小型猪RGS1基因克隆及内脏组织表达谱分析

为了研究广西巴马小型猪RGS1基因的生物信息学特点及其在高脂高糖饲养条件下的组织表达差异,采集其内脏组织样品,利用实时荧光定量PCR进行RGS1基因的表达差异分析,采用DNASTAR、TMH-MM等软件进行基因信息学分析.结果表明RGS1基因在肝脏以及背脂中表达量显著高于其他组织,实验组肝脏以及背脂中RGS1基因的表达量显著高于对照组.RGS1基因与GenBank中野猪参考序列(XM_003357617.4)对比发现,在第414位点存在一个碱基突变.广西巴马小型猪RGS1蛋白不存在跨膜结构,存在信号肽,属亲水性蛋白;三级结构预测符合RGS1蛋白,建模成功.说明广西巴马小型猪RGS1基因可能与体内的脂肪代谢存在一定的联系,其RGS1基因编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白.本试验研究了广西巴马小型猪RGS1基因在高脂高糖条件下的变化,后续可进一步与生产数据结合,如若结果一致,可以为糖尿病的建立提供参考依据.     

广西巴马小型猪TRβ1基因真核表达载体的构建及鉴定

本试验为了克隆广西巴马小型猪甲状腺激素受体β1(TRβ1)基因编码序列并构建该基因的真核表达载体,取广西巴马小型猪肝脏组织作为材料,采用RT-PCR技术扩增出TRβ1基因编码序列,与pMD19-T-Simple载体连接,测序正确的重组质粒双酶切后,连接pEGFP-N1载体,构建pEGFP-N1-TRβ1真核表达载体。经双酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-N1-TRβ1转染293T细胞,培养48 h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光蛋白的表达情况。结果表明,本试验成功克隆了广西巴马小型猪的TRβ1基因cDNA序列,序列长度为1 368 bp,编码455个氨基酸,与参考序列的同源性为99.6%,有5处位点突变,且全为同义突变。阳性重组质粒pEGFP-N1-TRβ1转染293T细胞48 h后,在荧光显微镜下观测出绿色荧光表达。     

版纳微型猪近交系CATSPER3基因克隆、序列及发育进化分析

获得版纳微型猪近交系(BMI)CATSPER3基因部分编码区序列,通过生物信息学分析其氨基酸序列和进行不同物种间的同源性比较。以版纳微型猪近交系的公猪睾丸为材料提取RNA,RT-PCR方法扩增CATSPER3基因部分编码区序列,利用在线分析软件进行生物信息学分析。结果显示,扩增出CATSPER3基因部分编码区序列。生物信息学分析表明,推导氨基酸序列,编码蛋白分子量为19.397 3 k D,理论等电点为5.05;在氨基酸组成上,酸性氨基酸(Asp+Glu)有24个、碱性氨基酸(Lys+Arg)有16个,其中以亮氨酸(Leu)占13.3%、缬氨酸(Val)占9.6%、苏氨酸(Thr)占9.0%、苯丙氨酸(Phe)占8.4%、谷氨酸(Glu)占7.2%,天冬氨酸(Asp)占7.2%等含量较高。在核苷酸相似度上与普通猪相似度最高,与山羊核苷酸的相似度较低;分子系统进化树表明与非近交系猪同处于一个分支中,亲缘关系较近,与山羊和绵羊亲缘关系较远。     

猪口蹄疫病毒受体通用亚基αv的基因克隆及序列分析

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的决定因素。研究发现,至少有四种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8是口蹄疫病毒(FMDV)的受体,其中αv是4种受体的通用亚基。首次从口蹄疫病毒实验感染猪的肺组织中克隆到了通用亚基αv基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪αv亚基基因的编码区含有3141个核苷酸,编码1046个氨基酸,其N-端30个氨基酸为信号肽,其后的胞外域、跨膜区、胞浆域分别由955、29、32个氨基酸组成;胞外域含有11个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)、2个Ca2 结合位点(DX[D/N]XDGXXD)、18个半胱氨酸残基。猪αv基因与牛、人、猕猴、家鼠、鸡、犬的αv基因的核苷酸序列同源性分别为93.3%、91.5%、91.4%、85.6%、73.2%、89.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.3%、94.6%、94.1%、90.8%、81.6%、93.8%,猪与牛αv亚基同源性最高,表明受体αv亚基可能与口蹄疫病毒的宿主范围有关。     

广西巴马小型猪Glut4基因克隆和真核表达

葡萄糖转运蛋白4(Glut4)是调控肌肉葡萄糖代谢的关键因子。本研究旨在克隆广西巴马小型猪Glut4基因,构建真核表达载体,转染C2C12细胞,研究Glut4功能。以广西巴马小型猪背最长肌组织作为实验材料,通过RT-PCR技术扩增出Glut4基因编码序列,连接入PMD18-T克隆载体,测序鉴定正确后提取克隆质粒。用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切克隆质粒,获得Glut4片段,连接至p EGFP-N1载体上,构建p EGFP-N1-Glut4表达载体,提取p EGFP-N1-Glut4重组质粒转染至C2C12细胞,观察细胞荧光表达情况,并检测转染24 h和48 h时培养液的葡萄糖水平。实验结果表明:广西巴马小型猪Glut4基因编码区序列长1 530 bp,编码509个氨基酸,与参考序列(序列号为EU590115.1)的同源性为99.7%;重组质粒转染C2C12细胞能表现出绿色荧光。转染24 h和48 h时,p EGFP-N1-Glut4组细胞培养液的葡萄糖浓度均显著低于空载体组(16.08±0.49 vs.17.13±0.13,4.93±0.19 vs.6.28±0.12,p0.01)。在C2C12成肌细胞中过表达广西巴马小型猪Glut4基因,能增加细胞的葡萄糖摄入量。     

猪ANK1新的可变剪接体功能预测、组织表达谱分析与真核表达载体构建

为进一步了解猪ANK1基因,本研究以广西巴马猪作为实验对象,分析ANK1基因结构与功能,并利用实时荧光定量PCR方法,分析ANK1基因在广西巴马小型猪11个不同组织(心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,大肠,小肠,胰腺,皮下脂,胃,背最长肌)中的表达水平。组织表达谱分析结果表明ANK1基因在11个组织中均有表达,mRNA表达量表现为:胰腺心脏背最长肌胃大肠肝脏肾脏小肠脾脏肺脏脂肪。ANK1基因编码的蛋白通过生物信息学分析表明,编码156个氨基酸,存在跨膜结构和跨膜信号肽,分子量为17 799.27,理论等电点6.31,α螺旋和无规则卷曲所占比例比较大。通过酶切技术成功获得p EGFP-ANK1重组质粒并转染到C2C12细胞中,于48 h拍照发现细胞发出荧光,说明ANK1基因真核表达载体构建成功。     

小型猪CYP3A88基因克隆与其他动物的序列比较

目的克隆我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中的CYP3A88基因,并进行生物信息学分析。方法应用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术对其全长进行扩增,测序,利用Internet和GenBank数据库对其序列进行生物信息学分析。结果首次克隆并鉴定了我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中CYP3A88（GenBank登录号：EF625347）的编码区,获得大小为1965bp的全长cDNA,编码区长为1512bp,编码503个氨基酸;比较核苷酸序列,与小型猪CYP3A39相似性高达94%,而与人等其它动物的CYP3A相似性则在86%以下;推导和分析氨基酸序列表明,与小型猪CYP3A其它成员（CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22）进行对比,其相似性分别为92%,89%,80%,而将小型猪与人的CYP3A分别比对,小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性最高,为77%;对其二级结构预测,它可能含12个α螺旋,4个β折叠;经NCBI上的CDD程序分析可知,其39～491氨基酸区域为P4503A亚家族保守结构区域;经聚类分析,小型猪和狗的CYP3A与人有较近的进化关系;通过同源建模法对其在线建模,人CYP3A4晶体结构作为其模建模型,得到了其经典的三维结构。结论在猪CYP3A家族四个基因中,CYP3A88在序列和高级结构上均与人CYP3A4的最为相似。     

巴马香猪Toll样受体4基因cDNA的克隆及生物信息学分析

目的研究TLR4在猪自然免疫中的作用及机制,为抗病育种及免疫佐剂的开发提供依据。方法利用NCBI公布的TLR4基因序列设计引物,RT-PCR技术克隆巴马香猪TLR4基因。结果所得基因序列提交GenBank,登录号：GQ304754。经序列分析,发现巴马香猪TLR4基因开放阅读框长2526 bp,编码785个氨基酸,该蛋白等电点为6.58,分子量为96.4×103;与普通猪比对发现巴马香猪TLR4基因有5个碱基发生突变;与小鼠、狗、鸡、牛、羊和人的同源性分别为71.9%、81.5%、54.2%、86.4%、85.5%和81.9%;TLR4膜外区蛋白为背侧多个α螺旋和内侧多个β折叠平行交替排列构成一个弯曲状螺旋结构;N末端存在信号肽,且可能在23～24位氨基酸处存在裂解位点;胞外区有13个明显的LRR,分别位于第53～74、77～100、101～124、149～173、174～192、201～225、372～393、398～429、446～469、470～494、495～518、519～541、543～566位氨基酸区;膜外区含8个N连接的糖基化位点。结论本研究成功克隆巴马香猪TLR4基因,为进一步研究该基因的功能和蛋白质的特性奠定了基础。     

三种小型猪线粒体DNA控制区的比较研究

目的分析五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪线粒体DNA控制区碱基序列,比较研究不同猪种的遗传标志。方法应用PCR技术分别对这三种小型猪的血液总DNA样品中线粒体DNA D-loop区进行扩增,测序比对。结果猪的线粒体DNA D-loop区分三个区域。I区（靠近5’端区域）704bp,五指山小型猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点中归纳出3个单倍体,而巴马小型猪在此区有9个变异位点,通过9个变异位点归纳出4个单倍体,贵州香猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点归纳出3个单倍体。Ⅱ区（串联重复序列区）,五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪序列相同。Ⅲ区（靠近3’端区域）三种小型猪的序列几乎相同。结论五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪三种小型猪之间线粒体DNA碱基序列变异位点较少,五指山小型猪和巴马小型猪亲缘关系较近。     

合作小型猪T细胞受体α链的基因结构及其多样性

目的探讨猪TCR基因分子结构的复杂性及其与人类的相似性。方法以公开的猪TCRα链基因为参考序列设计两对特异性引物,用RT-PCR法从合作小型猪外周血、淋巴结和脾脏的淋巴细胞中克隆了93个猪TCRα基因(简称STA)。结果测序分析表明,克隆的猪TCRα链的基因均含有可变的信号肽区和V区、高变的J区和恒定的C区的基因片段,但基因间的核苷酸序列组成都不完全相同,且具有十分复杂的多态性和多样性,基因间的同源性在68.4%~98.7%,这与TCRα链的基本基因结构特征相一致。依据TCRα基因的同源性对其分子结构、遗传演化关系和归类分析发现,在其信号肽区、FR1区和CDR1区、FR2区和CDR2区以及FR3区和CDR3区都存在一些变异集中点和变异热点区。用IMGT/V-QUEST分析方法可将合作小型猪TCRαV区(STAV)、J区(STAJ)基因片段与人类的进行比较分析,发现合作小型猪TCRα与人类的遗传演化关系较近,每个序列都能找到与人类对应的TRAV、TRAJ基因片段,甚至V区的相似性可达92%以上。结论近交培育的合作小型猪在正常状态具有应对外界复杂微生物等环境的TCR遗传多样性分子基础,且适合作为人类免疫学及疾病研究的动物模型。     

陆川猪GPR1基因的克隆及生物信息学分析

本试验旨在对陆川猪G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1,GPR1)基因进行克隆及相关生物信息学分析。本研究根据NCBI上公布的野猪GPR1基因序列设计引物,应用RT-PCR技术扩增得到包含全长编码区在内的基因片段,应用生物信息学软件对陆川猪GPR1基因的理化性质,修饰结构,二级结构和三级结构进行分析。结果显示:GPR1基因编码区全长1 068 bp,编码355个氨基酸;与NCBI上公布的野猪(NM_001190244.1)、牛(NM_001206545.1)、人(NM_005279.3)、猕猴(AF100204.1)、小鼠(NM_146250.2)、大鼠(NM_012961.1)GPR1基因氨基酸序列的同源性分别为98.9%、90.4%、86.5%、86.2%、78.2%、77.4%。陆川猪的GPR1蛋白有七个跨膜螺旋结构,不存在蛋白信号肽。GPR1蛋白存在两个N糖基化位点和多个潜在磷酸化位点。本研究成功克隆陆川猪GPR1基因完整的编码区序列,为今后GPR1基因在陆川猪的脂肪沉积及脂肪代谢方面的研究提供了理论依据。     

广西巴马小型猪内源性反转录病毒类型群体检测

抽样检测广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV),了解广西巴马小型猪携带PERV的情况。为培育无PERV广西巴马小型猪提供依据。对广西巴马小型猪PERV-A、PERV-B基因亚型以及陆川猪PERV-C基因亚型进行基因克隆分析,三种亚型基因克隆片段与NCBI上的目的片段一致,确保了PCR分型方法检测PERV的准确性。根据通用的env基因分型方法检测广西巴马小型猪群体内PERV-A、PERV-B、PERV-C基因的存在情况。在50份巴马小型猪样品中,96%的样品中存在PERV-A亚型,100%的样品存在PERV-B亚型,所有广西巴马小型猪样品中都不存在PERV-C亚型;其中,有96%的样品同时存在PERV-A、PERV-B两种亚型,而在24份陆川猪样品中有58.3%存在PERV-C型。广西巴马小型猪没有检测到PERV-C亚型,可以作为无PERV小型猪的培养对象,具有很好的应用前景。