ADRP基因在宗地花猪及其杂交猪不同组织中的表达分析

为研究ADRP基因在宗地花猪及其二元杂交猪不同组织中的表达规律,探讨该基因与脂肪含量的关系,试验以宗地花猪及其二元杂交猪为材料,采用实时荧光定量PCR技术,检测ADRP基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、背最长肌及脂肪中的相对表达量。结果表明,ADRP基因在宗地花猪及其杂交猪各组织中均有表达,不同组织之间及不同猪种之间的表达存在差异,表达丰度关系宗地花猪的为小肠脂肪肺脏肝脏心脏背最长肌脾脏肾脏,宗江二元猪的为脂肪小肠脾脏肺脏肾脏肝脏背最长肌心脏;显著性检验结果显示,宗江二元猪肝脏、脾脏、肺、小肠、背最长肌中ADRP基因的相对表达量显著高于宗地花猪的(p0.01),心脏、肾脏和脂肪组织中的表达量显著低于宗地花猪的(p0.01)。结果提示,ADRP基因在宗地花猪及其二元杂交猪不同组织中的差异表达可能与脂肪沉积有关。     

广西巴马小型猪SLC30-A8基因克隆及组织表达差异分析

本研究的目的是克隆广西巴马小型猪SLC30-A8基因,并确定各组织的表达量。利用RT-PCR的方法扩增并克隆SLC30-A8基因;荧光定量PCR检测SLC30-A8基因在12月龄广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、小肠和脂肪中的表达。结果显示,成功克隆广西巴马小型猪SLC30-A8基因CDS区全长1 110 bp,荧光定量PCR结果显示SLC30-A8基因在12月龄广西巴马小型猪胰腺组织中表达量最高,其次是心脏、脾脏,在肺脏、小肠以及脂肪组织中几乎不表达。本研究成功克隆了广西巴马小型猪SLC30-A8基因并确定在胰腺组织中表达最高。该研究将为下一步研究SLC30-A8基因在糖尿病的发生过程中对糖代谢的作用奠定基础。     

广西巴马小型猪PGC-1α基因克隆与组织表达分析

目的克隆广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区（CDS）序列,利用RT-PCR和QRT-PCR方法分析PGC-1αmRNA组织表达情况。方法本实验以广西巴马小型猪背最长肌cDNA为模版,PCR扩增PGC-1α基因CDS序列,将其连接至pEASY-T5载体,转染细菌、验证和序列测定;通过RT-PCR半定量和QRT-PCR实时荧光定量检测PGC-1α基因在小型猪多个组织中的表达情况。结果克隆获得广西巴马小型猪PGC-1α基因CDS序列,全长2391 bp,编码796个氨基酸,与参考序列的同源性为99.9%,两处碱基发生同义突变,分别是C-A1105和GA1524;PGC-1α基因在广西巴马小型猪心脏和肾脏中的表达丰度最高,其次是肝脏、皮下脂肪和背最长肌,而在胰腺中未检测到其表达。结论成功克隆了广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究PGC-1α在小型猪2型糖尿病发生过程中作用途径打下基础。     

威宁绵羊GHR基因克隆及组织表达

本试验以6月龄、1周岁和2周岁的威宁绵羊公母羊为研究对象,利用分子手段对威宁绵羊GHR基因编码区序列进行克隆,并进行生物信息学分析,此外,本试验同时采用实时荧光定量PCR的手段对GHR基因在威宁绵羊不同性别及不同生长阶段心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及背最长肌6个组织中mRNA水平上的表达规律进行探究,结果显示:威宁绵羊GHR基因CDS区序列长度为1 905 bp,发现2个SNP位点。GHR基因在威宁绵羊各组织均有不同程度的表达,在不同性别、不同生长阶段相同组织中的表达具有一定的显著性差异。     

鸡PPARs基因组织表达特性的研究

以8周龄Arber Acres(AA)肉鸡为研究材料,采用RT-PCR和Northern blot方法对鸡PPAR基因组织表达特点进行了研究。RT-PCR半定量检测显示,在检测的10种组织中除胸部肌肉组织外,PPAR-α基因在其他9种组织中都表达,其中较高表达于脑、肺脏、肾脏、心脏和小肠,中等程度表达于胃、肝脏和脂肪,较低表达于脾脏。PPAR-γ基因除了在肝脏和肌肉中没有检测到外,在其他8种组织都有表达,其中高表达于脂肪,其次是脑和肾脏,低量表达于脾脏、心脏、肺脏、胃和小肠。Northern blot检测显示,PPAR-α基因在心脏、肝脏、肾脏和胃这4种组织表达,其中在肝脏杂交信号最强;PPAR-γ基因只在脂肪和肾脏表达,其中在脂肪组织有强的杂交信号。以上结果表明,鸡PPARS基因的组织表达特点同啮齿动物和人基本一致,但也有其自身的特殊性,即PPAR-α基因不在肌肉组织中表达,PPAR-γ基因在肾脏中有高表达。PPAR基因与鸡的多种组织的生长和发育有关。     

广西巴马小型猪RGS1基因克隆及内脏组织表达谱分析

为了研究广西巴马小型猪RGS1基因的生物信息学特点及其在高脂高糖饲养条件下的组织表达差异,采集其内脏组织样品,利用实时荧光定量PCR进行RGS1基因的表达差异分析,采用DNASTAR、TMH-MM等软件进行基因信息学分析.结果表明RGS1基因在肝脏以及背脂中表达量显著高于其他组织,实验组肝脏以及背脂中RGS1基因的表达量显著高于对照组.RGS1基因与GenBank中野猪参考序列(XM_003357617.4)对比发现,在第414位点存在一个碱基突变.广西巴马小型猪RGS1蛋白不存在跨膜结构,存在信号肽,属亲水性蛋白;三级结构预测符合RGS1蛋白,建模成功.说明广西巴马小型猪RGS1基因可能与体内的脂肪代谢存在一定的联系,其RGS1基因编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白.本试验研究了广西巴马小型猪RGS1基因在高脂高糖条件下的变化,后续可进一步与生产数据结合,如若结果一致,可以为糖尿病的建立提供参考依据.     

广西巴马小型猪Glut4基因克隆和真核表达

葡萄糖转运蛋白4(Glut4)是调控肌肉葡萄糖代谢的关键因子。本研究旨在克隆广西巴马小型猪Glut4基因,构建真核表达载体,转染C2C12细胞,研究Glut4功能。以广西巴马小型猪背最长肌组织作为实验材料,通过RT-PCR技术扩增出Glut4基因编码序列,连接入PMD18-T克隆载体,测序鉴定正确后提取克隆质粒。用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切克隆质粒,获得Glut4片段,连接至p EGFP-N1载体上,构建p EGFP-N1-Glut4表达载体,提取p EGFP-N1-Glut4重组质粒转染至C2C12细胞,观察细胞荧光表达情况,并检测转染24 h和48 h时培养液的葡萄糖水平。实验结果表明:广西巴马小型猪Glut4基因编码区序列长1 530 bp,编码509个氨基酸,与参考序列(序列号为EU590115.1)的同源性为99.7%;重组质粒转染C2C12细胞能表现出绿色荧光。转染24 h和48 h时,p EGFP-N1-Glut4组细胞培养液的葡萄糖浓度均显著低于空载体组(16.08±0.49 vs.17.13±0.13,4.93±0.19 vs.6.28±0.12,p0.01)。在C2C12成肌细胞中过表达广西巴马小型猪Glut4基因,能增加细胞的葡萄糖摄入量。     

猪激素敏感脂酶和甘油三酯水解酶基因组织表达特性研究

以八眉猪为研究对象,采用RT-PCR和Western blot方法对猪激素敏感酯酶(HSL)和甘油三酯水解酶(TGH)基因组织表达特点进行了研究。RT-PCR半定量检测显示,HSL基因的mRNA在检测的7种组织中都有表达,其中在脂肪组织表达量较高,中等程度表达于心脏、肝脏、肺、脾和肾脏。TGH基因在7种组织也均有表达,其中肝脏和脂肪组织表达量较高,心脏和肾脏次之,脾脏和肺脏表达量较低。Western blot检测显示,HSL基因在大网膜脂肪和皮下脂肪表达量最高,而在肾脏中没有检测到表达,其他组织中中度表达;TGH基因在大网膜脂肪、皮下脂肪、肝脏、肺脏和脾脏组织中表达,其中在脂肪组织和肝脏组织中表达量最高,而在心脏和肾脏中没有检测到表达。以上结果表明:HSL和TGH基因存在转录后调控,这可能与其在不同组织中的功能差异有关。     

巴马香猪和杜长大猪的PDK4基因的克隆及组织表达分析

为了获得广西巴马香猪和杜长大猪丙酮酸脱氢酶激酶4 (PDK4)基因编码区序列(CDS),并研究PDK4基因在广西巴马香猪和杜长大猪不同组织中的mRNA表达差异,本研究利用基因克隆技术分别从巴马香猪和杜长大猪的背最长肌组织中提取总RNA,PCR扩增出PDK4基因CDS,并进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术检测PDK4基因在这两品种猪不同组织中m RNA的相对表达量。结果表明:本研究分别成功克隆获得巴马香猪和杜长大猪PDK4基因CDS,长度为1 224 bp,这两品种猪的PDK4基因CDS同源性为100%,与GenBank报道的普通猪、人、鼠、马、羊的同源性分别为100%、91.0%、85.5%、92.3%、93.0%。基于PDK4基因碱基同源性构建的物种系统进化树可知,巴马猪和杜长大猪遗传距离是最近的,最远的是小鼠。两品种猪PDK4氨基酸组成中亮氨酸含量较高,占总氨基酸数的10.8%,同时发现PDK4蛋白具有较强的亲水性。巴马香猪和杜长大猪PDK4蛋白的高级结构中均包含有α螺旋、无规卷曲和延伸链。实时荧光定量PCR结果显示,巴马香猪和杜长大猪的不同组织PDK4基因表达量最高的为腹脂,最低的是脾。巴马香猪背最长肌中PDK4基因表达水平极显著高于杜长大猪,而杜长大猪的皮脂、腹脂、肝、脾以及肾中PDK4基因表达水平极显著高于巴马香猪。本试验成功克隆了巴马香猪和杜长猪的PDK4基因,并且检测了该基因在两品种猪不同组织中的基因表达水平的差异,为今后深入探讨PDK4基因在地方猪种脂质代谢和脂肪沉积方面发挥的作用奠定工作基础。     

藏猪和大约克猪MYL1基因多态性及差异表达分析

为研究猪不同品种的MYL1基因的多态性及mRNA表达差异.本试验以藏猪和大约克猪作为实验动物,采用一代测序技术对藏猪(59头)和大约克猪(58头)MYL1基因起始密码子上游3 kb区域进行多态性检测;利用实时荧光定量PCR技术检测MYL1基因在背最长肌、背脂、肝脏组织差异表达情况.结果表明:藏猪和大约克猪在起始密码子上游3 kb区域发现T-159A突变位点并呈极显著差异(P＜0.01);MYL1基因在背最长肌表达量最高,其次是背脂,肝脏的最低,在背最长肌中藏猪MYL1基因表达量极显著高于大约克猪(P＜0.01),在背脂和肝脏组织中,藏猪MYL1基因表达量显著高于大约克猪(P＜0.05).推测T-159A位点可能是参与肌肉生长发育的重要调控位点.本研究为下一步开展MYL1基因对猪生长性能及其肉品质的影响提供参考依据.     

广西巴马小型猪GK基因真核表达载体的构建及鉴定

GK基因在糖尿病的发生中具有重要功能,本研究旨在构建广西巴马小型猪GK基因真核表达载体,为生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定一定基础。以广西巴马小型猪肝脏组织为材料,通过RT-PCR的方法扩增并克隆猪GK基因的编码序列,并进行生物信息学分析,并将GK基因亚克隆至p EGFP-N1载体上,构建含有GK基因的真核表达载体p EGFP-N1-GK,经过PCR和双酶切的验证,通过脂质体转染,将重组质粒p EGFP-N1-GK转染猪的PK15细胞,48 h之后通过荧光显微镜观察细胞荧光蛋白的表达。研究结果表明广西巴马小型猪GK基因编码区序列长1 575 bp长的片段,共编码524个氨基酸,与Pubmed中查询到的猪(FJ436399.1)的GK基因同源最高,序列比对发现,在461 bp和534 bp处都发生了C-T的碱基突变,只有461 bp位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,成功构建p EGFP-N1-GK真核表达载体,并在PK15细胞中成功转录表达。为进一步研究葡萄糖激酶基因(GK)与糖尿病之间的关系,以及生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定基础。     

PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪不同组织中的表达水平探究

为探究PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪不同组织中的表达与脂肪沉积的关系,本实验以10月龄苏太猪为研究对象,运用实时荧光定量PCR (q RT-PCR)技术检测PPARγ与c/EBPα基因mRNA在苏太猪心、肝、脾、肺、肾、胃、背最长肌和皮下脂肪8个组织中的表达水平。结果表明,PPARγ与c/EBPα基因在苏太猪的8个组织中均有不同程度的表达,其中,PPARγ基因在苏太猪脾脏组织中的表达量最高,皮下脂肪中的表达水平仅次于脾;以背最长肌中PPARγ基因的相对表达量作对比,背最长肌与脾、肺和皮下脂肪的相对表达差异极显著(p<0.01),其余为差异不显著(p>0.05),表达量高低顺序为脾>皮下脂肪>肺>心>胃>肾>肝>背最长肌;c/EBPα基因在苏太猪的皮下脂肪的表达量最高,以背最长肌中c/EBPα基因的相对表达量作对比,在肝、脾、皮下脂肪组织中表达差异极显著(p<0.01),肺的相对表达差异显著(p<0.05),其余组织中差异不显著(p>0.05),表达量的高低顺序为皮下脂肪>肝>脾>肺>肾>心>胃>背最长肌。两基因在各组织中表达趋势趋于一致。试验结果表明PPARγ和c/EBPα基因可能对猪脂肪沉积有重要影响。     

不同品种猪背最长肌中IGF-1-PI3K/AKT通路基因的生长发育表达模式差异

本文研究了广西巴马小型猪和长白猪背最长肌中IGF-1-PI3K/AKT信号通路相关基因的发育表达模式的差异,为今后研究巴马小型猪的生长发育和肉质性状提供分子理论基础.克隆猪INSR、IRS1、IGF-1、PI3K、PI3KR1、PDK1、PTEN、AKT1、FoxO1、mTOR、4EBP1和β-actin基因,构建荧光定量PCR标准曲线,采用实时PCR法检测上述基因在广西巴马小型猪和长白猪出生后1、30、60、90、180 d背最长肌的表达变化.在同一生长发育阶段,PTEN和4EBP1基因的表达均极显著高于同一品种其他基因的表达,FoxO1、PI3KR1和AKT1基因中度表达,IGF-1、INSR、IRS1、PI3K、PDK1基因低度表达;在不同生长发育阶段基因的表达存在显著差异;两个品种猪在同一生长发育时间的表达也存在差异.本研究结果表明广西巴马小型猪和长白猪IGF-1-PI3K/AKT通路相关基因的表达呈现出明显的品种差异性和时空差异性,PTEN、FoxO1和4EBP1基因表达差异可能是两个品种猪肌肉产量和肉质性状存在差异的原因之一.     

广西巴马小型猪2型糖尿病模型骨骼肌糖代谢及能量代谢相关基因的表达差异

目的探讨糖代谢及能量代谢过程中的关键调控基因(PGC-1α、Glut-4、ERRα、NRF-1、TFAM和线粒体基因)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)发生中的作用。方法以广西巴马小型猪T2DM模型建立的发病组和未发病组的背最长肌为实验材料,利用QRT-PCR实时荧光定量的方法对糖代谢及能量代谢相关基因mRNA和线粒体基因的表达情况进行检测。结果在广西巴马小型猪背最长肌中,T2DM组PGC-1α、Glut-4、ERRα和NRF-1的相对表达量均显著高于非T2DM组,TFAM和线粒体基因的相对表达量则稍低于非T2DM组。结论在T2DM巴马小型猪骨骼肌中,上调PGC-1α及其下游基因Glut-4、ERRα和NRF-1的表达水平,有利于改善葡萄糖代谢;而线粒体合成不足,致使ATP合成量不够,或引起胰岛素抵抗,进而导致2型糖尿病的发生。     

藏山羊FGF1基因克隆、生物学特征及组织表达分析

本研究旨在克隆藏山羊FGF1基因的CDS序列,并获得其生物学特征,同时阐明其组织表达规律。选取2.5周岁健康公藏山羊6头,采集皮下脂肪、背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织样品,提取组织总RNA,利用RT-PCR方法克隆FGF1基因序列,同时利用实时定量PCR检测其m RNA在不同组织中的表达水平。结果表明,获得藏山羊FGF1基因序列1 165 bp(Gen Bank登陆号:KX509990),其中CDS为468 bp,5'UTR 255 bp和3'UTR 422 bp,编码155个氨基酸,藏山羊FGF1基因与山羊(KT899959)的核苷酸同源性为99.57%,氨基酸同源性为99.35%。FGF1 m RNA在藏山羊皮下脂肪组织中的表达水平较高,极显著高于其他组织(p0.01)。本研究将为进一步研究藏山羊FGF1基因的结构和功能提供参考资料。     

屯昌猪MYLPF基因序列分析及其组织表达量检测

为获得屯昌猪MYLPF基因的CDS区序列并分析其分子结构特征,研究屯昌猪、杜洛克猪以及其杂交F1代猪不同组织中的MYLPF mRNA表达水平,本研究以GenBank上公布的猪MYLPF基因序列(登录号:NM_001006592)为参考设计引物,通过RT-PCR扩增、测序获得屯昌猪MYLPF基因CDS区.结果显示:该基因CDS区长度510 bp,编码169个氨基酸,在CDS区存在33 G＞T的同义突变;该基因编码产物既没有跨膜结构,也不存在信号肽,属于非分泌型蛋白,主要在细胞质中发挥作用,预测存在1个潜在的糖基化位点和9个磷酸化位点,α螺旋区域在预测的二级结构中占比最大.荧光定量PCR检测结果显示MYLPF基因在屯昌猪背最长肌中表达量最高,屯昌猪背最长肌中MYLPF mRNA的表达量均显著高于杜洛克猪及其杂交F1代猪.本研究为探明MYLPF基因对猪肌内脂肪的影响提供了分子理论依据.     

广西巴马小型猪TRβ1基因真核表达载体的构建及鉴定

本试验为了克隆广西巴马小型猪甲状腺激素受体β1(TRβ1)基因编码序列并构建该基因的真核表达载体,取广西巴马小型猪肝脏组织作为材料,采用RT-PCR技术扩增出TRβ1基因编码序列,与pMD19-T-Simple载体连接,测序正确的重组质粒双酶切后,连接pEGFP-N1载体,构建pEGFP-N1-TRβ1真核表达载体。经双酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-N1-TRβ1转染293T细胞,培养48 h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光蛋白的表达情况。结果表明,本试验成功克隆了广西巴马小型猪的TRβ1基因cDNA序列,序列长度为1 368 bp,编码455个氨基酸,与参考序列的同源性为99.6%,有5处位点突变,且全为同义突变。阳性重组质粒pEGFP-N1-TRβ1转染293T细胞48 h后,在荧光显微镜下观测出绿色荧光表达。     

绵羊ILK基因的克隆及其在毛囊生长期的表达

整合素连接激酶(ILK)是一种支架蛋白,在毛囊发育过程中发挥重要作用。文章利用PCR技术,首次获得绵羊ILK基因的编码区全长序列,并进行了生物信息学分析;同时对该基因的组织表达谱及其在不同绵羊品种毛囊生长期皮肤组织中的表达变化进行了研究。结果表明,绵羊ILK基因ORF全长1 359 bp,编码452个氨基酸。ILK蛋白结构经预测含有3个锚定重复序列和1个激酶结构域,并存在多个磷酸化位点和蛋白激酶C的磷酸化位点。半定量RT-PCR结果显示该基因在绵羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌、皮肤和小肠组织中均有表达,皮肤、脾脏和肝脏中表达量较高;实时荧光定量PCR结果表明在3~5月份(毛囊生长起始期),ILK基因在中国美利奴超细型和哈萨克羊皮肤组织中的表达水平较高并均呈逐月上升趋势;在6~10月份(毛囊生长期),中国美利奴超细型皮肤ILK基因表达水平高于同期的哈萨克羊。分析认为ILK可能在调控绵羊次级毛囊生长发育过程中起一定作用。     

广西巴马小型猪ABCA1基因真核表达载体的构建与鉴定

本研究目的是克隆广西巴马小型猪ABCA1基因CDs序列并构建真核表达载体。利用RT-PCR技术从广西巴马小型猪肝脏组织中扩增出ABCA1基因编码序列,直接插入至pEGFP-N1真核表达载体的KpnⅠ酶切位点,构建出重组质粒。之后将重组质粒pEGFP-N1-ABCA1转染PK15细胞,并于24 h、48 h后观察细胞荧光表达情况。收集转染48 h后的PK15细胞通过qRT-PCR检测ABCA1 mRNA相对表达量。结果表明:本实验成功构建了广西巴马小型猪ABCA1基因真核表达载体,重组质粒pEGFP-N1-ABCA1转染PK15细胞后,有绿色荧光蛋白表达,且与转染pEGFP-N1和空白组相比,pEGFP-N1-ABCA1转染组的ABCA1 mRNA表达量显著提高。本研究为下一步研究ABCA1基因的功能和调控及生产转ABCA1基因广西巴马小型猪奠定基础。     

猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析

从人骨骼肌快肌肌钙蛋白C2（TNNC2）基因出发,在dbEST数据库中进行同源性搜索,找到一个有较高同源性且在猪背最长肌中表达EST（BM083186）。通过电子克隆和进一步RT-PCR实验验证,获得猪TNNC2基因全长cDNA序列,其全长843bp,开放阅读框为201～683bp,编码有160个氨基酸。同源性分析结果表明,与人、鼠的骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为93.6％、90.5％,蛋白序列同源性均为97.5%。多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在骨骼肌中表达,并且在杜洛克猪背最长肌中的表达比兰塘猪高。