pCR3．1—bvLDH-C4′的构建及在体内外的表达

精子特异性乳酸脱氢酶(LDH—C4)在精子的运动和存活等生理活动中起着重要的作用。研究表明,LDH—C4接种鼠、兔等能够降低动物的生育率。通过RT—PER方法从布氏田鼠睾丸总RNA中克隆出编码抗原决定簇的LDH—C4基因片断;采用T—A克隆的方法将其插入到pCR3．1载体中构建重组载体pCR3．1—bvLDH—C4′,测序结果表明克隆的基因片断与已知小鼠相应片断有83％的序列同源。通过质脂体法转染HeLa细胞,RT—PCR证实其可在mRNA水平有效表达;通过肌肉接种BAIB/c小鼠,RT-PER结果表明其在体内也可有效表达。     

截短的人精子特异性乳酸脱氢酶L178X突变体丧失催化活性

精子特异性乳酸脱氢酶(乳酸脱氢酶C4,LDH-C4)是精子能量代谢的关键酶类之一.为了研究前期发现的1个LDH-C4基因突变(L178X)对LDH-C4功能的影响,在已构建的LDH-C4原核表达载体pET-28a(+)-hLDHC的基础上,利用PCR定点诱变技术,制备了L178X突变体的原核表达载体pET-28a(+)-hLDHC/L178X,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,诱导其表达.对该载体进行限制性酶切表明,插入的LDHC基因cDNA约1000bp;序列分析表明,该插入片段读框正确,带L178X突变.SDS-PAGE及免疫印迹显示,携带该载体的菌体可表达分子量约25kD的蛋白质,后者可被兔抗LDH-C4血清特异识别.乳酸脱氢酶(LDH)活性测定及活性染色表明,所表达的产物没有LDH活性.本研究成功进行了LDH-C4的1个突变体的原核表达,为研究LDHC基因突变对LDH-C4功能以及男性生育的影响奠定了基础.     

高原鼠兔脑组织中精子特异性乳酸脱氢酶的作用

高原鼠兔对高原低氧环境有很强的适应性。研究发现,精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)基因在高原鼠兔脑组织中表达,为阐明LDH-C4在高原鼠兔脑组织中的作用,应用荧光定量PCR和Western blot方法,测定了Ldh-c基因在高原鼠兔脑组织中的表达水平;应用对精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)特异性的抑制剂(N-isopropyl oxamate),通过肌肉注射后,研究抑制剂对高原鼠兔脑组织中LDH比活力、乳酸和ATP含量的影响。结果表明,在mRNA和蛋白水平,Ldh-c基因在高原鼠兔脑组织中均有表达,相对表达水平分别为0.38±0.05和0.74±0.13;当肌肉注射1 m L 1 mol/L的抑制剂30 min后,血液中抑制剂浓度为0.08 mmol/L;与对照组相比,抑制剂组脑组织中LDH比活力、乳酸和ATP含量显著下降,抑制剂对LDH、乳酸和ATP的抑制率分别为30.78%、46.47%和21.04%。结果表明,精子特异性乳酸脱氢酶基因在高原鼠兔脑组织中表达。LDH-C4通过催化无氧糖酵解过程,为其脑组织生命活动提供至少20%的ATP,可能使高原鼠兔减小在低氧环境中对氧气的依赖,增强对低氧环境的适应能力。     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的 克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达.方法 采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达.结果 构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Unev,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×103的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础.     

小鼠Oct4基因真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建小鼠Oct4基因真核表达载体并对其表达进行鉴定.方法:以小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)cDNA为模板克隆Oct4基因编码区序列,将其通过定向克隆插入pcDNA3.1(+)栽体多克隆酶切位点(multiple cloning sites,MCS)中,形成pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体.将pcDNA3.1(+)空载体和pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体分别转染293T细胞,通过Western Blotting检测Oct4蛋白的表达.结果:成功检测到Oct4蛋白的表达.结论:成功构建了小鼠Oct4基因真核表达载体.     

重叠延伸PCR法构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体

目的:构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体.方法:将10 ug LPS和等体积的完全福氏佐剂乳化后皮下注射C57BL/6小鼠,7天后,取小鼠脾脏,提取脾细胞总RNA,通过RT-PCR克隆小鼠EBI3和IL-12p35 cDNA;采用重叠延伸PCR,通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3全长基因和IL-12p35成熟肽基因,构建小鼠IL-35单链融合基因(Inouse sigle chain IL-35,mscIL-35),并将其克隆至pcDNA3.1/V5-His TOPO TA载体.通过酶切和测序鉴定阳性重组载体.结果:DNA序列分析结果表明:小鼠IL-35单链融合基因中EBI3、IL-12p35和linker的连接顺序、方向及序列完全正确.结论:成功构建了小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体,为进一步探讨IL-35的生物学功能奠定了基础.     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.     

乳腺特异性表达催乳素基因载体的构建与检测

催乳素(prolactin,PRL)可通过PRL-PRLR-JAK/STAT信号通路促进乳腺发育,启动并维持泌乳。为了探讨调控PRL基因表达对奶水牛产奶量的影响,该研究构建了乳腺特异性表达PRL基因的核移植载体并检测了其有效性。首先,利用RT-PCR方法克隆得到804 bp的水牛PRL基因编码区;而后逐步采用酶切加连接方法,依次将PRL基因、β-酪蛋白(β-casein,BCN)启动子和标记基因插入p IFN-BCNpoly A质粒中,构建得到14.2 Kb的转PRL基因载体。将表达载体瞬时转染人Bcap-37细胞系,经RT-PCR检测发现,目的基因PRL可在该细胞系中表达。将该载体转入水牛胎儿成纤维细胞中,通过核移植法获得了转PRL基因水牛克隆胚胎。该文结果表明,所构建的PRL核移植载体可表达PRL基因,并可用于生产转PRL基因克隆水牛胚胎。     

小鼠IL-27真核表达载体的构建及其在RAW264.7 细胞中的表达

目的:构建小鼠白介素27(Interleukin 27,IL-27)单链融合基因的真核表达载体并检验其在RAW264.7细胞中的表达情况。方法:提取小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出小鼠EBI3和p28 c DNA。采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3和p28基因片段,构建小鼠IL-27单链融合基因(mouse single chain IL-27,msc IL-27),并将其克隆至pc DNA3.1(+)载体。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体,将重组质粒pc DNA3.1-IL-27通过脂质体转染法转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果:测序分析表明,小鼠IL-27单链融合基因中EBI3、linker和p28的连接顺序、方向及碱基序列与预期相符。在转染后的RAW264.7细胞中检测到了小鼠IL-27 m RNA的表达。结论:成功构建了小鼠IL-27单链融合基因及其真核表达载体,并在RAW264.7细胞中实现表达,为进一步探讨IL-27的生物学功能奠定了基础。     

乳腺注射法表达人组织型纤溶酶原激活剂的研究

目的 :构建tPA乳腺定位表达载体 ,使其在牛乳汁中高效表达 ,观察目的基因表达的规律及其影响因素 ,为建立新型牛乳腺生物反应器提供理论基础。方法 :RT-PCR法克隆目的基因 ,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含tPA-cDNA的乳腺定位表达载体 ;采用乳腺注射法将融合基因转入小鼠及牛的乳腺组织中。结果 :乳腺注射外源基因后 ,tPA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 :乳腺注射法可使目的基因在乳腺组织中稳定地表达较长的时间 ,其表达量与显微注射法没有明显的差异 ,表明外源基因的表达不受转基因方法的影响。但tPA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量 ,提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异 ,可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

小伞山羊草中新型avenin-like基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆小伞山羊草中新型avenin-like（类燕麦储藏蛋白）基因,揭示avenin-like基因的表达模式,并构建avenin-like基因真核胚乳特异性表达载体。方法：利用RT-PCR方法揭示avenin-like基因的表达模式,并用PCR方法从小伞山羊草中克隆新型avenin-like基因;将克隆的avenin-like基因插入表达载体pLRPT构建真核表达载体pLRPT-avel,并经酶切和测序鉴定。结果：avenin-like基因在胚乳中特异性表达;克隆得到新型avenin-like基因,并构建了其真核胚乳特异性表达载体。结论：新型avenin-like基因的克隆及其真核表达载体的构建,为小麦品质改良提供了研究基础。     

黄瓜花叶病毒互补型载体可与CP转基因发生重组

为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)作为表达载体的可行性,克隆了山东株(SD)CMV RNA3的全长cDNA,并测定了全序列.采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点.以绿色荧光蛋白(GFP)基因置换SD-CMV RNA3 cDNA的CP基因.将Fny株CMV RNA1,RNA2和嵌合SD-CMV RNA3的cDNA分别克隆在35 S启动子和终止子之间构建成表达载体.在烟草原生质体中验证了该表达载体可以表达GFP.然后将其接种到表达SD CP的转基因烟草上,试图构建成一个互补型载体.接种10d后,18棵植株中,有5棵的接种叶和其中1棵的系统叶上可检测到表达的GFP.然而1个月后,所有接种植株中都检测不到GFP.通过RT-PCR及序列分析,证实在互补系统中CMV载体与CP转基因发生了重组.上述结果对这种CMV互补型载体的可行性提出了质疑,同时也揭示了转CMV CP基因抗病毒植物的生物安全性中存在的新的问题.     

慢病毒介导Nanog基因在小鼠ES细胞的表达

试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。结果显示通过RT-PCR扩增出918bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。根据小鼠Nanog基因m RNA序列设计Nanog基因引物,引物两端带有Nhe I和Xho I酶切位点。Trizol试剂处理小鼠ES细胞,通过RT-PCR扩增出小鼠Nanog基因,小鼠Nanog基因用Nhe I和Xho I酶切后连入pcDNA3.1载体中,PCR检测阳性的细菌克隆进行测序,测序正确的Nanog基因片段连接入PLL-IRES-Neo慢病毒表达载体中,包装含有Nanog基因的慢病毒感染小鼠ES细胞,在SNL细胞饲养层上G418筛选2周后,添加普通ES细胞培养液在普通小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养。结果显示通过RT-PCR扩增出918 bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。     

大鼠促甲状腺激素释放激素受体1基因的克隆及其在COS-7细胞系中的表达

目的:克隆大鼠促甲状腺激素释放激素受体1(TRH-R1)基因,构建其真核表达载体,并检测该基因在非洲绿猴肾细胞系COS-7中的表达。方法:应用RT-PCR方法,以大鼠脑源RNA为模板,扩增获得TRH-R1基因,定向克隆到pDsRed2-N1中,以LipofectAMINE 2000试剂转染pDsRed2-N1-TRH-R1表达载体至COS-7细胞系中进行瞬时表达。结果:测序结果表明,从大鼠脑源总RNA中克隆到正确的TRH-R1基因全长编码序列;显微照相观察到所构建的TRH-R1表达载体质粒在COS-7细胞系中获得有效表达。结论:大鼠TRH-R1基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7细胞系中表达获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础。     

兔IFRG基因的克隆及表达分析

实验通过对兔子基因组DNA进行PCR获得兔IFRG基因,将其克隆到pGEM-T载体,双酶切鉴定和测序结果表明成功构建了重组克隆载体pGEM-T-IFRG。通过RT-PCR分析发现IFRG基因在兔不同组织中有不同程度的表达。将重组克隆载体pGEM-T-IFRG和表达载体pET-41（c）经过EcoR1和Xho1双酶切后连接构建重组表达载体pET-41（c）-IFRG,将双酶切鉴定正确的重组表达载体转化入E.coli BL21,IPTG诱导融合蛋白的表达,SDS-PAGE结果显示兔IFRG基因在大肠杆菌中得到了良好的表达。     

不明原因男性不育人群中睾丸特异性乳酸脱氢酶基因突变的发现及其意义

为了研究睾丸特异性乳酸脱氢酶,即乳酸脱氢酶C4(LDH-C4)基因突变在男性不育发病中的作用,利用LDH-C4特异性底物对100名不明原因男性不育症患者的精子LDH-C4进行活性显色,用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对LDH-C4活性低下的患者进行LDHC基因PCR产物的突变筛查,对DHPLC峰形异常的PCR产物进行序列测定.筛选到一组精子LDH-C4活性明显下降的患者,其中1名患者的LDHC基因PCR产物在DHPLC中呈异常洗脱峰.对这一PCR产物进行序列测定,发现患者LDHC基因第5外显子的115位碱基发生了T→A的杂合改变(GenBank登录号GU479375),该突变使LDHC基因的178位密码子由原来的TTG(编码亮氨酸)变为TAG(终止密码子),形成截短的C亚基.T克隆-测序进一步证实了该无义突变的杂合状态.这是在人类LDHC基因上发现的第一个突变,提示LDHC基因突变可能是男性不育发病的原因之一.     

脂联素siRNA对3T3-L1细胞基础葡萄糖转运的影响(英文)

目的:构建携带小鼠脂联素(Acrp30)siRNA腺病毒载体,并检测其对小鼠脂肪细胞Acrp30表达以及对3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖转运的影响。方法:设计并化学合成小鼠脂肪细胞Acrp30 siRNA片断,将其亚克隆入AdEaxy XL腺病毒载体系统,在293细胞内包装扩增为重组腺病毒。用此重组腺病毒感染3T3-L1脂肪细胞,用RT-PCR和ELISA检测其Acrp30 mRNA和蛋白表达。采用2 Deoxy-[3H]D-glucose掺入法测定脂肪细胞葡萄糖转运。结果:设计并构建了小鼠Acrp30基因特异性siRNA腺病毒载体,该载体感染脂肪细胞后,能显著抑制Acrp30 mRNA和蛋白表达,影响3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖的转运,与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:构建的Acrp30基因特异性siRNA腺病毒载体能有效的抑制脂联素在3T3-L1脂肪细胞中的表达,从而影响3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖转运。     

牛c-myc基因的克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达

为了构建包含牛c-myc基因编码序列的重组载体,以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛c-myc 基因的编码序列,将其亚克隆至pMD19-T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pIRES2-AcGFP1-Nuc表达载体上,挑选序列正确的重组真核表达质粒转染牛皮肤成纤维细胞,用RT-PCR和Western blotting分别检测c-myc mRNA和蛋白的表达。结果表明,从胎牛原始生殖嵴中正确克隆了c-myc基因的全长编码序列,所构建的重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中有效     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建北大核心

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

抗人VEGF受体Ⅱ基因Ⅲ区单链抗体基因的构建和表达

采用RT-PCR技术从分泌抗人血管内皮生长因子受体Ⅱ（kinase insert domaincontaining receptor,KDR）基因Ⅲ区单克隆抗体Ycom1D3的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,通过重叠延伸拼接（spliceoverlap extension）PCR方法在V_H和V_L基因之间引入柔性短肽（Gly₄Ser）₃,体外构建Ycom1D3单链抗体基因Ycom1D3-ScFv）,将其克隆至pAYZ表达载体,在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明,Ycom1D3-ScFv在E.coli 16C9中获得表达,重组蛋白的相对分子量为30kD,与预期结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,TALON 金属亲合层析基质（TALON metal affinity resin）纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实该单链抗体可与人脐静脉内皮细胞结合,保留了鼠源单抗与KDR抗原的特异性结合活性。抗KDRⅢ单链抗体基因Ycom1D3-ScFv的成功构建和功能性表达为靶向诊断治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。