高原鼢鼠肌肉脂溶性物质的抗缺氧效果与化学成分

为了确定高在鼢鼠（Myospalax baileyi)体内抗缺氧水成分,通过超临界萃取（SCEF）方法从高原鼢鼠肌肉提取脂溶性部分,我们对其成分通过气相色谱－质谱（GC－MS）联用分析。为了证实高原鼢鼠肌肉脂溶性成分的抗缺氧效果,探讨其抗缺氧机制,我们以小鼠为实验动物,分为5个组,即高剂量实验组（HEG）,中剂量实验组（MEG）,低剂量实验组（LEG）,阳性药物对照组（PEG）,空白对照组（CEG）,分别以浓度为20％萃取物,10％萃取物,5％萃取物,10％的红景天和蒸馏水连续饲喂10天,然后进行小鼠常压抗缺氧实验,测定小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）,谷光甘肽过氧化物酶（GSH－PX）,乳酸脱氢酶（LDH）活性及血清丙二(MAD)含量。结果发现,高原鼢鼠肌肉脂溶性物质提取率为11．5％,共确定了17种成分,主要成分是n-十六烷酸（32．293％）,n-十廿烷酸（1．109％）,n-十八烷酸（6．03％）,二－羟基－环十五酮（1．198％）,顺十六烯酸（6．13％）,反十八烯酸（27．3％）,和亚油酸（81．4％）,小鼠抗缺氧实验和生化指标测试结果表明,高原鼢鼠肌从脂溶性成分在20％,10％,5％时,与空白对照组相比,都不同程度地延长小鼠在缺氧条件下的存活时间,提高小鼠血清SOD和GSH－PX活性,降低血清LDH活性,减少血清MDA含量。     

高原鼠兔肝中Ldh-c基因的表达及其对无氧糖酵解水平的影响

高原鼠兔(Ochotona curzoniac)对高原低氧环境有很强的适应性。我们研究发现,精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)在高原鼠兔肝组织中表达。为了阐明LDH-C4对高原鼠兔肝组织无氧糖酵解水平的影响,将20只高原鼠兔随机分为抑制剂组和空白对照组,每组10只。抑制剂组注射1 mol/L LDH-C4特异性抑制剂N-异丙基草氨酸盐(N-isopropyl oxamate)于高原鼠兔股二头肌,双侧各注射500μl,空白对照组注射等剂量的0.9%生理盐水。应用荧光定量PCR和western blot方法,测定了精子特异性乳酸脱氢酶基因(Ldh-c)在高原鼠兔肝组织中的表达水平,应用高压液相色谱法测定了血液中抑制剂的浓度,用生物化学方法测定了抑制剂组和空白对照组高原鼠兔肝组织中乳酸脱氢酶(LDH)比活力以及乳酸(LD)和ATP含量。结果表明,在m RNA和蛋白水平,Ldh-c基因在高原鼠兔肝组织中均有表达,m RNA相对表达水平为0.22±0.04,蛋白相对表达水平为0.97±0.20;当肌肉注射1 mol/L的抑制剂30 min后,血液中抑制剂浓度为0.08 mmol/L,肝组织中乳酸脱氢酶比活力抑制剂组和空白对照组分别为(4 990±290)U/g和(7 360±420)U/g,抑制剂组和空白对照组乳酸含量分别为(0.38±0.05)mmol/g和(0.53±0.03)mmol/g,抑制剂组和空白对照组ATP含量分别为(5.84±0.83)μmol/g和(7.78±1.06)μmol/g,经单因素方差分析,抑制剂组的乳酸脱氢酶比活力和乳酸及ATP含量均显著下降(P0.01);抑制剂对乳酸脱氢酶比活力和乳酸及ATP含量的抑制率分别为30.19%±3.90%、32.22%±8.70%和24.94%±7.80%。以上结果说明,Ldh-c在高原鼠兔肝组织中表达,LDH-C4通过催化无氧糖酵解过程,为其肝组织生命活动提供至少24%的ATP,这可能使高原鼠兔减小了在低氧环境中对氧气的依赖,增强了对低氧环境的适应力。     

高原鼢鼠对低氧高二氧化碳环境适应的相关血液生理指标的季节变化

高原鼢鼠是终生生活于地下封闭洞道中的一种啮齿动物。为了探讨高原鼢鼠对低氧和高二氧化碳环境的适应机制,对春、夏和秋三季高原鼢鼠血液生理指标以及心肌和骨骼肌肌红蛋白含量进行了测定。春、夏和秋季高原鼢鼠动脉血和静脉血pH值分别为7.44±0.09、7.44±0.05、7.51±0.07和7.17±0.05、7.29±0.07、7.35±0.08,动脉血pH在不同季节没有显著性差异,静脉血pH春季显著低于夏季和秋季。动脉和静脉血二氧化碳分压(Pco2)分别为47.81±14.50mmHg、55.10±13.50mmHg、53.00±10.81mmHg和75.17±31.09mmHg、75.40±20.21mmHg、80.00±17.44mmHg,没有季节性差异;动脉和静脉血氧分压(Po2)分别为76.17±33.24mmHg、78.90±16.61mmHg、88.67±24.94mmHg和7.34±4.07mmHg、10.60±2.76mmHg、10.33±3.56mmHg,没有季节性差异;动脉和静脉血血氧饱和度(SaO2)分别为92.71%±5.00%、94.70%±3.65%、96.00%±4.38%和4.27%±3.03%、9.01%±5.26%、9.67%±6.02%,动脉血SaO2没有季节性差异,而静脉血SaO2春季显著低于夏季和秋季。血液红细胞数(RBC)、血红蛋白(Hb)和红细胞压积(HCT),从春季到冬季依次增加,并具有显著性差异,血清诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)活力随着夏季洞道中二氧化碳浓度的增加而显著提高。心肌和骨骼肌肌红蛋白(Mb)含量春季显著高于夏季和秋季,红细胞内2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)含量秋季显著高于春季和夏季。上述结果表明:随着洞道中氧气和二氧化碳浓度的季节波动,高原鼢鼠通过调节氧转运有关的功能蛋白含量以及氧代谢有关的生理机制维持组织的氧平衡。     

高原鼢鼠肝脏组织细胞周期相关基因的进化和表达

高原鼢鼠Myospalax baileyi是一种世居青藏高原的地下鼠,对严重的低氧环境有很强的适应性。低氧诱导细胞周期G1、G2期阻滞。为了探讨高原鼢鼠适应低氧环境的分子机制,应用生物信息学方法对p53下游细胞周期基因p21、CyclinD1、CyclinE、CDK6、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1的序列和编码的氨基酸序列进行了进化分析,并以SD大鼠Rattus norvegicus为对照,研究了这些基因在不同海拔(3300 m、2260 m)条件下的表达模式。结果表明:(1)高原鼢鼠细胞周期相关基因的序列与以色列鼹鼠Nannospalax galili同源性最高,达到90%以上;p21、CyclinD1、CyclinE和CyclinB1编码蛋白与以色列鼹鼠存在明显的趋同进化位点;SIFT评估发现,p21和CyclinB1氨基酸序列分别在第27号位点和第105号位点的变异对细胞周期调控功能有显著影响;(2)与低海拔条件相比,在高海拔条件下,高原鼢鼠肝脏组织中与G1期相关的基因p21表达水平显著上升,p21下游基因CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2表达水平显著下降,而在SD大鼠中没有显著变化;与G2期相关的基因Gadd45α、B99、14-3-3-δ和CyclinB1在高原鼢鼠和SD大鼠中随海拔变化不发生明显变化。在不同海拔条件下,高原鼢鼠肝脏组织中的上述细胞周期相关基因的表达水平均极显著高于SD大鼠(P<0.01)。以上结果提示,高原鼢鼠经过长期的低氧适应,通过上调p21基因的表达抑制下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2基因的表达,导致细胞周期G1期阻滞,从而提供充足的时间进行DNA修复,保证了DNA复制的准确性;同时高原鼢鼠肝脏组织中细胞周期的调控不仅与细胞周期基因的表达水平有关,而且可能与细胞周期因子p21的第27号位点和CyclinB1的第105号位点的变异有关。     

高原鼢鼠prestin基因的组织特异性表达与适应地下生活的关系

高原鼢鼠是青藏高原特有的地下鼠,地下鼠具有准确的空间定位能力。prestin蛋白是在耳蜗特异性表达且与回声定位有关的蛋白分子。为了探讨prestin基因与高原鼢鼠地下空间定位之间的关系,我们克隆了高原鼢鼠prestin基因的编码区序列,并与其他物种的prestin基因序列进行序列比对;运用PAML软件对高原鼢鼠的prestin基因进行进化分析;根据已克隆的序列,应用实时荧光定量的方法测定高原鼢鼠耳蜗、尾部、足垫和鼻垫组织中prestin基因mRNA的表达水平。研究结果表明,与人、大鼠、小鼠、裸鼢鼠、家兔和牛6种哺乳类动物相比,高原鼢鼠prestin基因编码的氨基酸序列显示存在9个氨基酸残基突变;Test2模型未检测到统计上显著的正选择位点;高原鼢鼠耳蜗prestin基因mRNA的表达水平显著高于高原鼠兔(P<0.05),高原鼢鼠耳蜗和尾部prestin基因mRNA的表达水平显著高于足垫和鼻垫（P<0.01）。以上结果说明,prestin基因不仅在高原鼢鼠耳蜗中表达,而且在尾部、足垫和鼻垫组织中也有表达。高原鼢鼠在地下洞道生活过程中,可能利用尾巴、前后足和鼻子辅助感知低频声波,从而准确地进行空间定位。     

缺氧引起的自由基增殖及其损伤

在缺氧条件下,生物机体内自由基代谢紊乱,其浓度升高,机体抗氧化系统遭到破坏;高浓度自由基通过生物膜脂质过氧化,使生物膜流动性减小,刚性增强,通透性增大,细胞内钙超载,细胞信号传导异常;攻击蛋白质和酶,使其结构破坏,功能丧失。活性降低,导致物质代谢和能量代谢障碍;攻击DNA分子,使其发生突变甚至发生断裂,从而诱发机体病变。     

高原鼠兔脑组织中精子特异性乳酸脱氢酶的作用

高原鼠兔对高原低氧环境有很强的适应性。研究发现,精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)基因在高原鼠兔脑组织中表达,为阐明LDH-C4在高原鼠兔脑组织中的作用,应用荧光定量PCR和Western blot方法,测定了Ldh-c基因在高原鼠兔脑组织中的表达水平;应用对精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)特异性的抑制剂(N-isopropyl oxamate),通过肌肉注射后,研究抑制剂对高原鼠兔脑组织中LDH比活力、乳酸和ATP含量的影响。结果表明,在mRNA和蛋白水平,Ldh-c基因在高原鼠兔脑组织中均有表达,相对表达水平分别为0.38±0.05和0.74±0.13;当肌肉注射1 m L 1 mol/L的抑制剂30 min后,血液中抑制剂浓度为0.08 mmol/L;与对照组相比,抑制剂组脑组织中LDH比活力、乳酸和ATP含量显著下降,抑制剂对LDH、乳酸和ATP的抑制率分别为30.78%、46.47%和21.04%。结果表明,精子特异性乳酸脱氢酶基因在高原鼠兔脑组织中表达。LDH-C4通过催化无氧糖酵解过程,为其脑组织生命活动提供至少20%的ATP,可能使高原鼠兔减小在低氧环境中对氧气的依赖,增强对低氧环境的适应能力。     

高原鼢鼠和高原鼠兔红细胞低氧适应特征

为探讨高原鼢鼠对低氧高二氧化碳洞道生境及高原鼠兔对高海拔低氧生境的适应机制,用Sysmex SF-3000血细胞分析仪及聚丙烯酰胺凝胶电泳对两种高原动物的血常规及血红蛋白类型进行分析,后者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法。结果表明,高原鼢鼠和高原鼠兔的红细胞数(RBC)、红细胞压积(HCT)及平均红细胞容积(MCV)组间无显著差异(P>0.05),但高原鼢鼠和高原鼠兔的红细胞数显著高于SD大鼠,红细胞压积及平均红细胞容积均显著低于SD大鼠(P<0.05);高原鼢鼠的血红蛋白浓度(HBC)与SD大鼠无显著差异(P>0.05),但显著高于高原鼠兔的HBC(P<0.05)。高原鼢鼠血红蛋白主要有2种类型,高原鼠兔血红蛋白主要有3种类型,而SD大鼠血红蛋白主要有5种类型。从血红蛋白电泳迁移来看,2种高原动物血红蛋白类型有明显的趋同特征并与SD大鼠具有明显的差异。上述结果提示,长期适应高海拔低氧环境的高原动物的红细胞和血红蛋白表现出趋同进化,同时因生境和习性的差异又表现出各自的特异性。     

高原鼢鼠和高原鼠兔肺细叶的结构特征

高原鼢鼠和高原鼠兔是青藏高原土著动物,对低氧具有很好的适应性.为了探讨在低氧环境中两者肺细叶结构的适应特征,应用体视学方法测量了肺细叶相关指标.结果发现 :高原鼢鼠和高原鼠兔肺单位面积肺泡数显著高于SD大鼠,单个肺泡面积和弹性纤维/肺实质比显著低于SD大鼠;高原鼢鼠肺泡隔厚度最厚,高原鼠兔最薄,且三种动物具显著差异; 高原鼢鼠和高原鼠兔气-血屏障的算术平均厚度(Ta)和调和平均厚度(Th) 均显著低于SD 大鼠;在三个级别的微血管中,高原鼠兔中膜肌层厚度显著低于高原鼢鼠,两种高原动物均显著低于SD大鼠;高原鼢鼠和高原鼠兔的微血管密度(MVD)显著高于SD大鼠.以上结果表明,高原鼢鼠和高原鼠兔肺细叶结构特征表现出一定趋同,这些特征有利于在低氧条件下提高肺气体扩散容量;但是,肺泡隔厚度和微血管中膜肌层厚度/血管外径比又表现出明显的差异,可能是不同生境造成的[动物学报 54(3):531-539,2008].     

高原鼢鼠肺组织细胞凋亡相关 基因的进化分析及其在不同 海拔条件下的表达模式

高原鼢鼠（Myospalax baileyi）是青藏高原特有的地下鼠,其地下洞道严重缺氧。一般来说,低氧会促进细胞凋亡。为了探讨高原鼢鼠适应低氧环境的分子机制,本文应用生物信息学方法对p53下游凋亡促进基因Pidd、Fas、Bax、Puma、Apaf-1、Scotin、Perp、Igfbp3和凋亡抑制基因Bcl-2的序列和编码的氨基酸序列进行了进化分析,并以SD大鼠（Rattus norvegicus）为对照,研究了这些基因在不同海拔环境条件下（3 300 m和2 260 m）的表达模式。结果表明：（1）高原鼢鼠细胞凋亡基因的序列与以色列鼹鼠（Nannospalax galili）同源性最高;预测的PIDD、PUMA、Apaf-1、IGFBP3和BCL-2编码蛋白结构域与以色列鼹鼠的存在明显的趋同进化位点;SIFT评估发现,高原鼢鼠和以色列鼹鼠与其他物种相比,p53、PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3氨基酸序列分别在78、853、157、320和285号位点的变异对其功能有显著影响;（2）在高海拔条件下（3 300 m）,高原鼢鼠肺组织中凋亡促进基因Pidd、Bax、Puma和Apaf-1表达水平显著下降,凋亡抑制基因Bcl-2表达水平显著升高,而在SD大鼠中凋亡促进基因和凋亡抑制基因的表达水平均没有变化;高原鼢鼠中Bcl-2/Bax比值随海拔的升高显著上升,而在SD大鼠中没有变化。以上结果提示,高原鼢鼠p53结构变异可能导致其下游基因表达模式与SD大鼠不同,其中凋亡促进基因Pidd、Bax、Puma和Apaf-1表达水平下降,凋亡抑制基因Bcl-2表达水平上升,从而抑制了细胞在低氧条件下的凋亡;在长期低氧的作用下,高原鼢鼠p53下游基因产物PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3产生了影响其功能的变异位点,这可能改变了它们与发挥功能的复合物的结合力,从而抑制了细胞凋亡。因此,通过长期的低氧适应,高原鼢鼠肺组织中与细胞凋亡相关的基因产物结构发生变异,导致其基因表达水平发生变化,从而抑制细胞凋亡,这是高原鼢鼠适应地下低氧洞道生境的分子机制之一。