柞蚕蛹虫草代谢物组分分析及对高尿酸血症的作用

采用定量检测和代谢组学方法对柞蚕蛹虫草的成分和参与的代谢途径及通路进行了分析,并开展了其对嘌呤代谢障碍引起的高尿酸血症作用研究。结果表明,柞蚕蛹虫草共含有代谢产物233种,其中不仅含有定量检测已经报道的虫草素、虫草酸等成分,还含有皮质固醇、肾上腺素及谷胱甘肽等多种特殊代谢成分,这些成分主要隶属于羧酸及衍生物、有机氧化合物及脂肪酰基类等10个不同类别,KEGG分析其显著性富集在ABC转运蛋白、氨基酸生物合成及嘌呤代谢等19种代谢途径;动物试验结果表明,柞蚕蛹虫草中、高剂量组与模型组比较,血尿酸水平和黄嘌呤氧化酶活性均显著降低（P<0.05）,对防治高尿酸血症具有明显的作用,并对其作用机制进行了分析探讨。本研究为柞蚕蛹虫草在高尿酸血症作用及其相关药理学研究和开发应用提供了理论依据。     

虫草素产量不同的蛹虫草菌株代谢组差异

为探究虫草素高产和低产的两株蛹虫草菌代谢差异及其与虫草素代谢的关联性,本研究采用UPLC-QTOF-MS广泛靶向代谢组学技术和多元统计分析方法,结合相同蛹虫草菌不同发酵时间的菌丝体差异代谢物相对含量的变化情况,比较了两株蛹虫草菌相同发酵时间的菌丝体代谢差异。结果表明：蛹虫草CICC 14014菌株发酵第20和10天的菌粉（H20和H10）及其发酵液的虫草素含量都显著高于蛹虫草CGMCC 3.4655菌株（其菌粉为L20和L10）（P<0.01）。主成分模型显示H10、L10、H20和L20间分散明显;通过正交偏最小二乘法分析,以t检验P<0.05并且VIP>1为标准,从H10 vs L10和H20 vs L20分别识别出190和158种差异代谢物,其中具有生物活性的亚精胺为首次在蛹虫草菌中被检出;以P<0.01为标准,从H10 vs L10、H20 vs L20中筛选出2条显著富集的通路,分别为烟酸-烟酰胺和精氨酸-脯氨酸代谢通路。对H10 vs L10和H20 vs L20进行代谢调控网络分析,获得7条显著互作的通路,相同的互作通路为碱基切除修复。代谢网络分析结果表明抑制三羧酸循环、核黄素代谢、赖氨酸降解、鞘脂类代谢通路以及促进碱基切除修复、β-丙氨酸代谢、精氨酸-脯氨酸代谢、脂质代谢、嘌呤代谢通路有利于虫草素的生成;虫草素高产蛹虫草菌甘油三酯代谢和合成腺苷的能力高于虫草素低产蛹虫草菌;在嘌呤代谢途径中,腺嘌呤通过黄嘌呤代谢反馈促进虫草素的生物合成。本研究为蛹虫草菌生物活性成分的挖掘提供理论基础,为深入解析蛹虫草菌虫草素的代谢机制提供参考。     

基于代谢组学的功能性蛹虫草成分研究

对功能性蛹虫草、野生蛹虫草、柞蚕蛹虫草及冬虫夏草的代谢组学进行非靶向成分比较分析,并对功能性蛹虫草的常见生物活性成分进行定量分析。结果表明,功能性蛹虫草共检测出代谢产物成分2 213种,占成分总量的72.67%,其特有成分497种,与冬虫夏草、柞蚕蛹虫草和野生蛹虫草相比具有显著的成分优势。除目前已经报导的部分成分外,还含有丰富的特殊性代谢产物,如灵芝酸、茯苓新酸、人参皂苷、仙茅皂苷、苦玄参苷、黄芪皂苷、金铁锁环肽、王不留行环肽、甾醇、丹酚酸等。常规成分定量分析表明功能性蛹虫草子实体中虫草素和喷司他丁含量均较高,麦角甾醇、SOD酶、维生素E含量均显著高于对照组。大量药物活性物质在蛹虫草代谢产物成分体系中得到表达,对于揭示蛹虫草保健价值的物质基础具有重要意义。     

基于非靶代谢组学的糙皮侧耳子实体发育的关联物质及主要代谢通路分析

本研究采用代谢组学方法鉴定并分析了糙皮侧耳原基和刚分化的子实体中的小分子代谢物质,以期解析糙皮侧耳子实体形成和发育的潜在机制。糙皮侧耳原基和子实体中共鉴定出545种代谢物,包含酚酸、脂类、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、有机酸、生物碱、单宁、木脂素和香豆素以及其他代谢物共9类。主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)表明糙皮侧耳原基和子实体中的代谢物质具有显著差异。以VIP≥1、fold change≥2或≤0.5为条件,共筛选到253种差异代谢物。调控通路分析结果显示差异物质涉及76条代谢途径,推测该菌通过色氨酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,赖氨酸降解,D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢,生物素代谢,莨菪烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成,酪氨酸代谢,嘌呤代谢,丙酸代谢和异喹啉生物碱的生物合成等主要代谢通路完成物质的深度转化及调控。本研究为糙皮侧耳子实体发育机制的研究提供了一定的理论依据。     

柞蚕蛹虫草继代培育其活性物质变化规律

柞蚕蛹虫草中含有虫草素、腺苷、多糖等多种活性成分,具有提高免疫力、抗疲劳、保护心脑血管、抗癌等方面的作用,是冬虫夏草的良好替代品。以柞蚕蛹虫草的继代培育为基础,分别检测蛹虫草菌在不同传代次数时柞蚕蛹虫草子实体生长状态、蛹虫草中腺苷、虫草素、虫草多糖含量及蛹虫草菌菌丝、分生孢子中活性氧的分布。第1代蛹虫草菌接种后柞蚕蛹出现腐烂现象;第2、3代培育的子实体生长量、腺苷及虫草素含量均较高;第4代子实体生长量、腺苷及虫草素含量均出现大幅下降的现象。柞蚕蛹虫草中虫草多糖含量在传代过程中也逐渐降低,但降低幅度较腺苷和虫草素缓慢。第2代培育的柞蚕蛹虫草子实体生长状态优于第3代,故第2代蛹虫草菌更适合应用于批量生产。蛹虫草菌退化后含有活性氧的分生孢子比例增大,这可能是发生退化的表象之一。     

蛹虫草原基分化的差异蛋白质组学研究

蛹虫草子实体形成及发育的蛋白分子机制尚不清楚,本研究引入SWATH非标记定量蛋白质组学技术,对蛹虫草Cordyceps militaris 905菌株的菌丝体（mycelium,My）、原基（primordium,Po）、生长期子实体（developmental fruiting body,DF）和成熟期子实体（mature fruiting body,MF）进行了比较蛋白质组学分析。经搜库比对,从蛹虫草的My、Po、DF和MF中依次鉴定蛋白1 136个、1 090个、1 018个和997个（global FDR 1%）,经维恩分析后获得C. militaris 905蛹虫草表达蛋白1 578个。在此基础上,SWATH非标记技术定量蛋白1 109个。本研究获得了蛹虫草Po期与My期、DF期与Po期、MF期与DF期的差异表达蛋白,依次为115个、352个和104个,并对菌丝体分化形成原基的差异表达蛋白进行了重点解析。GO注释结果表明,Po期与My期差异表达蛋白以有机含氮类化合物代谢为主,其中AMP（活性成分虫草素合成的中间产物）从头生物合成途径富集最为显著。约1/5的差异表达蛋白参与氧化还原反应,还原酶活性的蛋白在原基中几乎都上调表达,而氧化功能的蛋白受到抑制,表明蛹虫草原基分化可能受到氧化应激的诱导。蛋白互作网络分析结果进一步表明,氧化还原反应与核苷类物质代谢相关联,可能通过影响AMP从头生物合成途径来调控虫草素的生物合成。对蛹虫草子实体系统的蛋白质组学研究和解析有利于揭示子实体形成的蛋白分子机制,为蛹虫草的基础和栽培研究提供了理论支撑。     

基于UPLC-MS/MS技术的代谢组学方法研究麸皮对杨树桑黄代谢的影响

桑黄孔菌属Sanghuangporus是一类具有重要药用价值的大型真菌,目前被国际公认为抗肿瘤效果最好的药用真菌之一。本研究以添加麸皮栽培的杨树桑黄Sanghuangporus vaninii子实体为研究对象,基于液质联用技术的广泛靶向代谢组学研究,从杨树桑黄子实体中检测出355种代谢产物,差异代谢物86种,上调51种,下调35种,主要集中在氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、糖及醇类、脂质、黄酮、生物碱、有机酸和酚酸等。KEGG代谢通路分析结果表明,差异代谢物富集于56条物质代谢通路,差异显著的有7条,分别为泛醌和其他萜类醌生物合成、次级代谢物的生物合成、色氨酸代谢、丙酸代谢、异喹啉生物碱生物合成和酪氨酸代谢。基于UPLC-MS/MS技术对杨树桑黄子实体进行代谢组学测定,确定麸皮的添加能够促进杨树桑黄次级代谢产物的合成和累积,为杨树桑黄的综合评价利用提供参考。     

基于广泛靶向代谢组学分析黑老虎不同部位成分差异

为提高黑老虎(Kadsura coccinea)资源的综合利用率，采用广泛靶向代谢组学技术鉴定并分析了根、茎、叶代谢组分差异及高度富集成分。结果表明，在根、茎和叶中分别鉴定出642、650和619个代谢物，以酚酸、脂质、类黄酮和有机酸为主；叶与根、茎与根的共有成分分别为566和650个，显著差异成分有442和393个，主要为酚酸、类黄酮和脂质，差异代谢物在苯丙烷生物合成、黄酮与黄酮醇生物合成通路中显著富集。代谢物总丰度和次生代谢物丰度均表现为叶>根>茎，叶中酚酸、类黄酮和脂质及茎中酚酸积累量显著高于根，而氨基酸及其衍生物、萜类、木脂素、香豆素、生物碱的丰度在根中显著上调。因此，黑老虎根、茎、叶有大量共有成分，叶和茎中酚酸、叶中类黄酮和脂质高度富集，含有新绿原酸、绿原酸、槲皮素等多个丰度较高且具有重要生物活性化合物，具有较高利用价值。     

蛹虫草光受体研究进展

光调控真菌的生长发育和代谢产物合成,是大多数食用菌子实体分化必不可少的环境因子。蛹虫草是一种具有重要药用价值的食用真菌,光因素对蛹虫草的分生孢子数量、生长速率、子实体发育、昼夜节律以及次级代谢产物虫草素和类胡萝卜素的合成均有较大的影响。目前,基于蛹虫草全基因组的解析和遗传操作系统的建立,已鉴定出7种光受体,white collar-1（WC-1）、WC-2、Drosophila-Arabidopsis- Synechocystis-human type cryptochromes（CRY-DASH）、CRY-2、环丁烷嘧啶二聚体光裂合酶（cyclobutane pyrimidine dimer,CPD）、VIVID（VVD）和光敏色素（phytochrome,PHY）。本文较系统地总结了上述光受体的蛋白结构特征,全面阐述了光受体介导光信号调控蛹虫草菌丝生长、子实体发育及次级代谢产物合成等方面的分子机制,并对后续研究进行了展望,为深入研究蛹虫草光受体的具体功能和相关机制提供参考。     

人工培养蛹虫草

用柞蚕的活蛹 ,大米米饭培养基培养蛹虫草菌 ,控制好环境条件 ,严格操作环节 ,可培养出与天然蛹虫草形态相同的蛹虫草子座。用棉籽壳、玉米芯、葵花盘粉碎物培养蛹虫草菌 ,可以得到抑菌杀菌物质 ,成本低廉 ,可利用此法提取广谱抗菌物质。     

蛹虫草病原真菌虫草生齿梗孢Calcarisporium cordycipiticola的生物学特性研究

蛹虫草已经成为我国乃至东南亚地区极其重要的食药用真菌,虽然其子实体已经实现规模化生产,但在产业发展中遇到许多问题,真菌病害为其中之一,如引起蛹虫草“白毛病”病害的虫草生齿梗孢Calcarisporium cordycipiticola。本研究以虫草生齿梗孢为对象,研究了其生物学特性、发病特性及侵染特点。结果表明：该病原菌菌丝分枝较多,短时间内产生大量分生孢子;最适生长温度为25℃,此温度有利于该病害快速传播;其分生孢子比蛹虫草分生孢子耐紫外能力强。栽培过程中该病害多发生在蛹虫草生长发育后期,可以侵染培养基表面、子实体底部、中部和顶端等各个部位。人工接种发现该病原菌可以侵染蛹虫草生长发育的任意阶段,后期子实体被白毛覆盖。对峙实验发现虫草生齿梗孢菌丝逐渐生长到蛹虫草菌丝上,但未发现两菌丝互相缠绕的现象。对该病原菌基本生物学研究,将为建立该病害的早期检测及预防方法提供依据。     

蛹虫草线粒体基因型快速检测体系的构建及线粒体遗传稳定性的初步研究

本研究的目的是建立一种快速确定蛹虫草菌株线粒体基因型的技术体系,并探讨蛹虫草连续传代培养后线粒体的遗传稳定性。从已知线粒体基因组的蛹虫草菌株中扩增线粒体内含子位点,将扩增产物混合并制作出两套DNA分子量标准,即在8个内含子位点分别具有内含子的8条扩增条带组成的M-I和在6个内含子位点分别缺失内含子的6条扩增条带组成的M-II。从待检测的蛹虫草菌株（包括3个已知和2个未知线粒体基因组的菌株）中扩增同样的（假定）内含子位点,然后通过琼脂糖凝胶电泳分别与制备好的两个DNA分子量标准进行比较,能够准确判断蛹虫草菌株的线粒体内含子分布模式,从而验证了所构建的线粒体基因型快速检测体系的有效性。选择10个蛹虫草组织分离菌株和8个单分生孢子菌株连续转接培养15代,没有发现线粒体内含子分布模式发生改变。本研究成功构建了快速检测蛹虫草线粒体基因型的技术体系,并发现蛹虫草线粒体具有很高的遗传稳定性,为开展蛹虫草线粒体遗传规律的研究奠定了基础。     

优良性状蚕蛹虫草的筛选及高产虫草素液态发酵条件优化

蛹虫草是重要的食药用真菌,虫草素为其主要活性成分,在抗肿瘤、抗菌、降血糖等方面具有较为突出的功效。蛹虫草菌株间的形态及环境条件差异,对菌株次级代谢产物虫草素产生影响显著。本研究对不同来源的6株蛹虫草菌株（YCC-B、YCC-C、YCC-H、YCC-W、YCC-Y、CGMCC 3.4655）,从蚕蛹体培养子实体性状,液体发酵条件（培养天数、培养方式、外源金属离子等）和传代稳定性等方面筛选优良性状菌株,提高其发酵合成虫草素的能力及稳定性。结果表明,蛹虫草菌株YCC-W在蚕蛹子实体出草及菌体液体发酵产虫草素上综合表现优良,传代稳定;液体发酵培养基中添加外源金属离子Mn²⁺作为酶的辅基,可以促进虫草素合成;采用振荡-静置相结合的混合发酵培养方式,可以避免单纯振荡培养溶氧量大、菌丝体生长旺盛,而虫草素产生不佳的问题。先振荡培养3d后静置培养至25d时,菌株YCC-W合成虫草素含量最高,可达(874.13±24.25)μg/mL,且稳定性良好。为进一步开发菌种及扩大规模生产提供参考。     

不同来源的蛹虫草子实体活性成分的比较

通过比较不同来源的蛹虫草子实体的活性成分以探讨蛹虫草品质的差异。对17个蛹虫草菌株栽培得到的子实体及16个市售样品中的多糖、核苷类成分、游离糖醇及小分子糖类的含量进行分析测定,并比较其核苷类成分HPLC指纹图谱。结果表明,因菌株不同蛹虫草子实体的活性成分具有不同程度的差异,菌株对虫草素含量的影响最大,其次是N ⁶-(2-羟乙基)腺苷,因菌株不同虫草素含量可相差14倍,N ⁶-(2-羟乙基)腺苷的含量差异可达6倍以上。市售样品中的核苷类成分分析结果也证明了在测定的几种成分中,虫草素是含量差异最大的活性成分。17个蛹虫草菌株子实体的多糖含量为1.81%-4.92%,甘露醇含量为1.44%-4.47%,海藻糖含量为3.58%-25.43%。16个市售样品的多糖含量为2.84%-5.55%,甘露醇含量为0.96%-3.93%,海藻糖含量为1.04%-19.91%。采用数据归一化法进行子实体品质综合评价研究,结果表明菌株G7a、G10a、G15a综合品质较好,多数成分含量均大于平均值,是生产高品质蛹虫草的合适菌株。     

糙皮侧耳不同生长时期发酵料中微生物和代谢物的变化

为了解糙皮侧耳栽培期间发酵料中的微生物及代谢产物变化,分别采用宏基因组测序、非靶向代谢组学技术对糙皮侧耳5个生长时期发酵料中微生物及代谢物进行分析。结果表明：糙皮侧耳生长发育过程中,发酵料中的Bacillus EGD-AK10、Cellulosinicrobium aquatile、Cellulosinicrobium cellulans、Cellulosinicrobium funkei、CellulosinicrobiumKWT-B、CellulosinicrobiumTH-20、Mycobacterium abscessus、Ochrobactrum intermedium 8种细菌的相对丰度与糙皮侧耳相对丰度呈显著正相关关系（P<0.01）,而Pseudoxanthomonas suwonensis和Thermobispora bispora与糙皮侧耳相对丰度呈显著负相关关系（P<0.05）。发酵料中微生物参与了发酵料的代谢,从而导致其中代谢物的变化。主成分分析（principal component analysis,PCA）结果表明,5组发酵料样品之间代谢物具有明显差异。采用正交偏最小二乘判别分析方法（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）从发酵料样品中共筛选和鉴定到100种差异代谢物,含量与糙皮侧耳相对丰度呈显著正相关的代谢物有36种,呈显著负相关的有19种,主要包括糖类、氨基酸、脂类和核苷酸。通过差异代谢物通路分析得到10条具有显著影响的代谢通路。与糙皮侧耳相对丰度呈显著正相关关系的8种细菌的相对丰度与上述36种代谢物的含量之间亦呈显著正相关关系（P<0.05）,意味着发酵料中的微生物、代谢物对糙皮侧耳的生长发育具有显著的影响。通过本研究将加深对细菌-真菌相互作用的了解,有利于食用菌产业的高质量发展。