南京椴HMGR基因的克隆和功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR）是植物萜类代谢中甲羟戊酸途径的关键酶,本研究运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,首次从珍稀植物南京椴中克隆出HMGR的全长基因TmiHMGR,其长度为2 160 bp,包含一个1 758 bp的开放阅读框,其推导蛋白TmiHMGR编码585个氨基酸残基,相对分子量为62.9 kD,pI为6.11。将TmiHMGR与其他植物HMGR氨基酸序列构建进化树,结果显示TmiHMGR与苹果的HMGR聚为一枝。采用半定量RT-PCR分析TmiHMGR在根、茎和叶中的表达情况,结果表明该基因在茎中的表达量最高,根和叶中的表达量相对较弱。验证功能的颜色互补实验结果显示,TmiHMGR能够使代谢流明显朝类胡萝卜素合成的方向进行,说明TmiHMGR在萜类产物生物合成中是一个重要因子。     

斑茅δ-OAT基因克隆及其序列分析

利用RT-PCR和RACE技术从斑茅（Erianthus arundinaceus）中分离出编码鸟氨酸-δ-氨基转氨酶基因的全长cDNA序列,序列全长1 680 bp,编码454个氨基酸。通过对哺乳动物、高等植物、微生物的δ-OAT基因编码的氨基酸序列进行同源比对,发现斑茅δ-OAT基因同其近缘属植物甘蔗的同源性最高（87%）,同其他高等植物的同源性次之（约为70%）,而同动物的同源性最低（约为60%）。在斑茅δ-OAT基因编码的氨基酸序列的5′端未发现线粒体定位序列,同甘蔗δ-OAT基因一样。斑茅δ-OAT基因具有完整的鸟氨酸转氨酶功能区rocD。利用定量RCR（real-time PCR）对30%PEG胁迫下的斑茅δ-OAT基因表达量进行研究,结果表明δ-OAT基因在胁迫12 h表达量达到最高,约为对照的4.1倍;胁迫2 h δ-OAT基因表达量反而有所降低。     

细纹豆芫菁3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR）是甲羟戊酸途径的关键酶。获得芫菁体内HMGR基因信息是确定甲羟戊酸途径与斑蝥素合成相关性的基础。本研究利用RACE技术从细纹豆芫菁Epicauta mannerheimi (Maklin)体内克隆获得HMGR基因全长cDNA序列, 命名为EmHMGR（GenBank登录号为JQ690539）。该基因全长3 118 bp, 其中5′端非翻译区178 bp, 3′端非翻译区414 bp, 开放阅读框2 526 bp, 编码842个氨基酸。推测的蛋白质分子量为92.8 kDa, 理论等电点为6.0, 预测分子式为C₄₁₃₅H₆₆₀₄N1₀₉₈O₁₂₁₆S₅₀, 不稳定系数为43.37, 总亲水性系数为0.091, 为疏水性不稳定蛋白。序列分析发现该基因编码的蛋白与已报道的其他昆虫HMGR的氨基酸序列一致性达50%以上, 而且包含HMGR_Class I保守功能域、 固醇敏感多肽区及HMGR蛋白的其他保守功能位点。系统进化分析发现该基因与叶甲科昆虫HMGR基因的关系最近。本研究首次从芫菁科昆虫体内克隆获得甲羟戊酸途径的关键酶EmHMGR基因, 为后期芫菁体内斑蝥素生物合成途径的研究奠定了基础。     

油菜BnMKK2基因的克隆及表达分析

通过实验从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAPK激酶基因BnMKK2基因的cDNA,全长1 344 bp,其中包括5′非翻译区（5′UTR）111 bp,3′非翻译区（3′UTR）165 bp,开放阅读框（ORF）长1 068 bp,编码355个氨基酸,该基因编码的蛋白质分子量为39.3 kDa,理论等电点为6.8。与拟南芥AtMKK2有很高的同源性,因此命名为BnMKK2(GenBank登录号:HQ848661)。该基因实时荧光定量PCR分析表明,BnMKK2基因的表达受低温胁迫诱导。     

小苍兰ACC合成酶FhACS1基因的克隆与序列分析

以小苍兰品种“上农金皇后”为研究对象,利用PCR技术和染色体步移技术首次克隆到了ACC合成酶FhACS1基因的全长序列和编码序列。结果表明：FhACS1基因全长为2 576 bp,包含长为433 bp的5′端非编码区序列（5′-UTR）以及长为373 bp的3′端非编码区序列（3′-UTR）;开放读码框（ORF）长度为1 371 bp,推定编码457个氨基酸。分析表明,该基因包含3个内含子和4个外显子。序列分析结果显示,FhACS1推导蛋白具备ACS蛋白的7个保守结构域;在氨基酸水平上,FhACS1与小果芭蕉的同源性最高（85%）;系统进化分析表明,FhACS1与孟宗竹BaACS（BAC56949.1）、水稻OsACS1（AAA33888.1）、小果芭蕉MaACS1（AAQ13435）的亲缘关系最近。在其已知启动子区域,发现有多个对脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素响应的顺式元件,以及对干旱和低温等逆境胁迫响应的顺式元件。     

长春花Crlea基因的克隆及原核表达初步分析

晚期胚胎丰富（Late Embryogenesis Abundant, LEA）蛋白是植物在干旱胁迫下响应并被描述为具有潜在的抗旱功能的一类重要的抗旱蛋白。通过建立干旱胁迫下长春花（Catharanthus roseus）的cDNA文库并进行测序筛选分析,首次分离得到Crlea（Crlea for Catharanthus roseus late embryogenesis abundant）全长基因。该基因具有492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸,其中偏性氨基酸含量占总蛋白的55.9%。同源性分析表明该假定蛋白与胡萝卜（Daucus carota）LEA DC3 的同源性达69%。亲水性分析表明具有极强的亲水性。为进一步验证CrLEA蛋白的功能,构建了Crlea基因的原核表达载体并在大肠杆菌中对其表达进行了分析。结果表明,原核载体成功的表达了CrLEA蛋白,亲水性实验及热稳定性实验表明CrLEA蛋白具有极强的亲水性和热稳定性。     

茶树肌动蛋白基因（CsActin1）全长cDNA克隆与生物信息学分析

以茶树（Camellia sinensis）萌动芽为材料,根据茶树萌动芽芽抑制消减杂交文库中分离得到的肌动蛋白（actin）基因的5′-片段设计引物,利用3′-RACE技术克隆了其cDNA全长序列,该基因cDNA全长1 470 bp,命名为CsActin1（GenBank登录号HQ235647）。序列分析表明,CsActin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区100 bp,3′非编码区236 bp。推测的蛋白质分子量为41.70 kD,等电点约为5.31,具有肌动蛋白家族的特征信号序列（YVGDEAQs.KRG和WIAKaEYDE）和肌动蛋白相关蛋白的特征信号序列（LLTEApLNPkaNR）。CsActin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在80%以上,氨基酸序列相似性在95%以上。与其它植物肌动蛋白的进化树分析结果表明,茶树肌动蛋白与杨树的两个肌动蛋白间的亲缘关系最为密切。并对推导的蛋白结构进行了分析。     

RT-PCR克隆甜菜硝酸还原酶cDNA全长序列及分析

根据GenBank中已公布的甜菜（Beta vulgaris）硝酸还原酶（nitrate reductase）基因序列（gb∣ABW05098.1∣）,设计引物,以50 mmol·L^-1 KNO₃溶液处理的甜菜幼苗为材料,从总RNA中通过RT-PCR分离得到一个硝酸还原酶基因,其cDNA长2 760 bp,包含了完整的基因编码序列,与已公布的硝酸还原酶基因序列相似性达99%。Southern杂交分析表明,硝酸还原酶基因在甜菜基因组中可能以两个拷贝或低拷贝形式存在。根据其编码的氨基酸序列,利用生物信息学预测了其亚细胞定位和蛋白质的三级结构。     

慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是调控植物木质素生物合成的关键酶,本文以慈竹为材料,利用RT-PCR技术克隆慈竹C3H基因,并对其进行生物信息学分析,为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明,该cDNA序列全长为1 581 bp,编码区为1 539 bp,编码512个氨基酸,蛋白分子量为58.33KD,等电点为9.09;氨基酸序列和结构分析显示C3H有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与毛竹和水稻的C3H基因具有很高的同源性。慈竹与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白为亲水性蛋白,这三种编码蛋白很可能定位在内质网(膜)上,其编码蛋白的二级结构及三级结构都含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,β-转角和延伸链的含量较少,都含有2个相对保守的无序化区域。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JF693629,可能与慈竹木质素的生物合成有关。     

番茄泛素蛋白基因LeEBF1和LeEBF2的克隆表达分析

通过RACE和RT-PCR方法从番茄中克隆了LeEBF1（EIN3 binding F-box protein 1）和LeEBF2（EIN3 binding F-box protein 2）的全长cDNA序列,两个基因LeEBF1、LeEBF2全长分别是2 866和2 891 bp,对序列的分析表明,它们的开放阅读框分别是1 911和1 995 bp,编码区编码637和665个氨基酸残基,在氨基端含保守的F-box区域和在羧基端有14个亮氨酸重复单位,通过BLAST软件和DNAMAN分析表明这两个基因的氨基酸序列与拟南芥EBF1和EBF2有58.6％相似,同时又与其他物种的EBF蛋白的F-box区域比较有24.4％到73.2％的相近。Northern杂交指出：LeEBF1与LeEBF2在野生型和Nr的幼叶中的表达量高于成熟叶;当在果实发育期,LeEBF1与LeEBF2在青果期的表达量相比其他时期要弱。初步结果表明,LeEBF1与LeEBF2可能在番茄的生长发育中起着重要的作用。     

植物萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的生物信息学分析

采用生物信息学的方法和工具对已在GenBank上注册的橡胶、烟草、辣椒、穿心莲等植物的萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、信号肽、跨膜拓朴结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行预测和推断。结果表明该类酶基因的全长包括5′、3′非翻译区和一个开放阅读框,无信号肽,是一个跨膜的亲水性蛋白,包括两个功能HMG-CoA结合motif及两个功能NADPH结合motif,α-螺旋和不规则盘绕是蛋白质二级结构最大量的结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,蛋白质的功能域在空间布局上折叠成“V”形,“V”形的两臂由螺旋状的N结构域和S结构域构成,中间部分由L结构域构成。     

Expression of HMGR and corresponding cholesterol content in tissues of two pig breeds

The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGR) is an essential enzyme in cholesterol biosynthesis. To study the expression of HMGR and corresponding cholesterol content in liver, adipose and muscle, six Chinese local breed (Huai pig) and Landrace pigs were selected. The results indicated that significant differences of cholesterol content in adipose (P < 0.01), liver (P < 0.05) and muscle (P < 0.01) tissues were detected between pigs of differing genetic backgrounds. HMGR mRNA expression were noted for adipose, liver and muscle of the two vastly differing genetics. Moreover cholesterol content differed (P < 0.01) among tissues across breed. Likewise, HMGR mRNA expression was different between adipose and liver tissues, muscle and liver tissues in both breeds; however, no difference was noted between adipose and muscle tissues. Results from this study indicate that cholesterol content and HMGR mRNA expression are higher in Huai pig tissues suggesting this gene is expressed in a breed- and tissue-dependent manner in pigs. Understanding the causes of variation in HMGR gene expression may provide crucial information about cholesterol biosynthesis.     

麦红吸浆虫3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR的克隆及在滞育与发育变态过程中的表达动态

【目的】3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是保幼激素(JH)合成途径的限速酶。麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana是一种典型的专性幼虫滞育昆虫。本研究旨在探讨HMGR基因在麦红吸浆虫滞育和发育变态过程中的作用。【方法】通过RT-PCR和RACE技术克隆麦红吸浆虫滞育前幼虫HMGR基因全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析HMGR基因核苷酸和其编码的蛋白氨基酸序列特性;采用qPCR技术测定其在麦红吸浆虫滞育不同时期3龄幼虫及不同发育阶段(1-2龄幼虫、预蛹、初蛹、中蛹和后蛹以及雌雄成虫)中的mRNA表达水平。【结果】克隆获得一条麦红吸浆虫HMGR基因全长cDNA序列,命名为SmHMGR(GenBank登录号: MG876766)。该基因全长2 548 bp,其中开放阅读框长2 328 bp,编码775个氨基酸,预测的蛋白分子量为84.16 kD,理论等电点为8.29。序列分析发现该基因编码的蛋白具有HMGR蛋白家族典型的HMG-CoA-reductase-classⅠ催化功能域及其他保守功能基序;序列比对和系统发育分析表明,SmHMGR与达氏按蚊Anopheles darling等长角亚目(Nematocera)昆虫HMGR的相似性最高、亲缘关系最近。SmHMGR在麦红吸浆虫滞育前的3龄早期幼虫中表达量显著升高,进入滞育后一直维持较高水平,并在滞育后静息阶段的当年12月至翌年1月达到最高。SmHMGR在蛹期表达量低于幼虫期,预蛹期表达量最低;在雌成虫中表达量显著高于在蛹和雄成虫中的表达量。【结论】SmHMGR的表达与麦红吸浆虫发育密切相关,可能在滞育诱导、维持及滞育后静息状态的维持及生殖中发挥作用,其表达量的降低可能参与了幼虫到蛹的变态。     

植物3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因研究进展

细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、叶绿素、萜类等类异戊二烯物质,是植物中广泛存在的一类代谢产物,在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。一些萜类化合物作为药物的合成前体或有效的药用成分在工农业及医药生产上具有重要的经济价值。类异戊二烯物质主要通过甲羟戊酸代谢途径中的一系列酶催化合成,其中,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)是该代谢途径中的第一个关键限速酶,能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成中间代谢产物甲羟戊酸。对植物HMGR基因的克隆、酶结构和功能分析、基因组织表达及调控等方面进行了综述,旨在为其在重要农作物的遗传改良、代谢产物工程植物创制以及植物亲缘关系分析中的应用等研究提供理论依据。     

3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 1 (HMG1) is highly associated with the cell division during the early stage of fruit development which determines the final fruit size in Litchi chinensis

3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR, EC: 1.1.1.34), an enzyme catalyzing the first committed step in the mevalonic acid (MVA) pathway for the biosynthesis of isoprenoids, has been reported to be involved in the fruit size determination through the regulation of early cell division. In litchi, the cell number achieved by this early cell division determines the final fruit size, but whether HMGR plays any role in this process was unknown. In this study, we set out to address this question with gene cloning and expression analysis in fruits of different pheno- or genotypes. We found that the litchi genome includes two HMGR homologues, denoted as LcHMG1 and LcHMG2. Despite 70% sequence identity at the amino acid level, they exhibited distinct expression patterns during litchi fruit development. LcHMG1 expression was highest in the early stage of fruit development, correlated with the high level of cell division. Absolute levels of LcHMG1 expression varied among fruits of different pheno- or genotypes, with expression in large-fruited types reaching higher levels for longer duration compared to that in small-fruited types. The expression patterns for LcHMG1 strongly suggest that this gene is involved in early cell division and fruit size determination in litchi. In contrast, LcHMG2 was most highly expressed in the late stage of fruit development, in association with biosynthesis of isoprenoid compounds required for later cell enlargement. These findings provided new insights on the function of HMGR genes during fruit development.