外源甜菜碱提高恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)DLL-1耐盐性的研究

研究了外源甜菜碱对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)DLL-1耐盐性的影响并对其渗透保护机制进行了初步的探讨;结果表明培养基中添加甜菜碱可以改善DLL-1细胞在高盐培养基中的生长情况,添加150mg/L的甜菜碱可以使DLL-1在1.2mol/L NaCl的基础盐培养基中生长,添加10mg/L的甜菜碱就足以显著缩短渗透胁迫条件下DLL-1细胞的延滞期和代时,增加生长量;和不添加对照相比,延滞期由24h缩短到6h,代时由60min缩短到35.7min,最大生长量OD610由1.29增长到1.57。在渗透胁迫条件下,细胞从外界快速吸收外源甜菜碱来代替自身相容性溶质的合成。     

中度嗜盐细菌Halomonas sp. BYS-1甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和表达

Halomonas sp.BYS1是一株能矿化苯乙酸的中度嗜盐细菌,该菌能在0～20% NaCl 的条件下生长。甜菜碱是其主要渗透保护剂,通过在培养基中添加甜菜碱合成前体(胆碱、甘氨酸)的方法发现它能以胆碱为前体合成甜菜碱。通过PCR的方法克隆了甜菜碱醛脱氢酶基因(betB),测序后在大肠杆菌中进行了高效表达,表达产物占菌体总蛋白的31.5%,酶活为38.5 U/mg,为构建耐盐的转基因植物提供了材料。     

富锌酵母的选育及培养条件研究

对402株不同种属的酵母菌株进行了出筛、复筛、单倍体分离、诱变,从亲株Y-6-16-18（a met）accharomyces cerevisiae）和Y378-4-15（α-leu）（Sacharomyces kluyveri）的杂交菌株中选育到一株富锌酵母菌株（编号为ZGH374）。并初步优化了发酵条件：培养基为80g/L糖浓度的麦芽汁、10g/L蛋白胨、锌添加量400μg/mL,pH 6.0,装液量40mL/250mL三角瓶,接种量10%（V/V）,培养起始添加锌盐,培养时间30h。在优化的条件下,杂交菌株ZGH374的生物量（细胞干重）达到14.3g/L,细胞锌含量可达到9.3mg/g,锌总含量达到了133mg/L。     

植物激素对破囊壶菌生长与产DHA的影响

研究了植物激素对破囊壶菌(Thraustochytrium roseum) MF2产DHA的影响作用。实验结果表明：植物激素对T.roseum MF2的生长和产DHA有很大影响;赤霉素(GA)能促进DHA的合成,6苄基腺嘌呤(BA)能显著促进T.roseum　MF2的生长,二者的配合使用能明显增加DHA的产量;培养基中适宜的添加量为2mg/L GA和3mg/L BA,可使DHA产量达到982mg/L。     

过量铜对4种外生菌根真菌的生长、碳氮和铜积累的影响

为了了解外生菌根真菌在过量铜胁迫下的生长和物质积累特点,揭示外生菌根真菌对过量铜胁迫的抵抗能力,研究了四种外生菌根真菌—美味牛肝菌(Boletus edulis)、铆钉菇(Gomphidius viscidus)、厚环乳牛肝菌(Suillus grevillei)和红绒盖牛肝(Xerocomus chrysenteron)在过量铜胁迫条件下菌丝中铜积累量、菌丝生长特性以及碳氮积累速率。四种测试菌种菌丝中的铜积累量,随营养液中铜浓度的增加而增加,在46mg/L铜培养基下生长15d,四种菌种菌丝内铜浓度分别是对照的40～60倍。B.edulis和X.chrysenteron菌丝中铜浓度与培养基中铜浓度呈直线相关,S.grevillei和G.viscidus为指数相关。菌丝在铜胁迫下依然呈S曲线增长,但初始生长推迟,指数增长期比对照晚1～2d。菌丝生物量和碳氮积累随铜浓度增加而显著降低。综合所有试验结果显示,四种测试菌种对过量铜的抗性强度为：B.edulis＞G.viscidus＞S.grevillei＞X.chrysenteron。     

一氧化氮对增强的UV_B胁迫下螺旋藻生物损伤的减缓作用

为了探讨一氧化氮对增强的UV_B胁迫下螺旋藻生物学特性的影响,通过色素含量、蛋白质含量和生物量3个方面的变化证实了05mmol/L的一氧化氮(Nitric oxide, NO)供体硝普钠(Sodium nitroprusside, SNP)对增强UV_B胁迫下的螺旋藻(Spirulina platensis)794细胞生物损伤有明显的减缓作用。实验结果显示,NO能够显著诱导增强的UV_B胁迫下螺旋藻细胞内蛋白质含量、脯氨酸含量的提高,促进正常生长条件下螺旋藻(Spirulina platensis)794细胞内抗氧化物质GSH含量的增多,但外源NO又可以降低增强UV_B胁迫下螺旋藻细胞中GSH含量的增加。说明NO对增强UV_B胁迫下的螺旋藻794细胞有保护作用,可以减轻UV_B胁迫对螺旋藻(S. platensis)细胞引起的生物损伤。首次研究报道了增强UV_B胁迫下NO信号分子对蓝细菌——螺旋藻细胞生物损伤调节能力的影响,为进一步探讨NO信号及其与其它信号分子之间相互作用、相互关联来调节细胞的生理生化过程,以减缓UV_B胁迫下的生物损伤机理奠定了基础。     

水翁悬浮细胞系的建立及其悬浮培养的生长特性

建立了水翁悬浮细胞系,并对其悬浮培养的生长特性作了初步探讨。以水翁新生芽尖作为外植体,接种于添加有不同浓度和配比的生长调节物质及各种附加物的MS固体培养基中,诱导培养产生初代愈伤组织;挑选Ⅰ和Ⅱ型的愈伤组织进行继代培养改良,考察愈伤组织的生长状况和统计生长量来决定最佳继代培养基的配方和得到适合悬浮培养的愈伤组织;将以上得到的愈伤组织转接于最佳继代液体培养基中,于24±1℃,120r/min条件下振荡培养,筛选分散度好、较均匀、生长快、色浅透明的细胞作为种子传代,数次传代后得到性能良好的悬浮细胞系;以细胞生长量(鲜重)为指标,绘制了水翁悬浮细胞的生长曲线。研究表明:2.0mg/L的2,4-D的诱导率最高(92%,初代愈伤组织为Ⅰ型),Ⅱ型愈伤组织的最高诱导率为75%;最佳的继代培养基配方为MS 0.5mg/L 2,4-D 0.5mg/L 6-BA 1.0mg/L IAA 0.5mg/L IBA 0.5mg/L NAA 0.1mg/L KT 700mg/L LH,形成Ⅱ型愈伤组织的生长量可达3.28g/瓶(鲜重);液体继代培养3代后,可得到性能良好的悬浮细胞系;水翁悬浮细胞的生长曲线表明,最佳接种期为培养后的16~18d。     

嗜酸乳杆菌的生长与富硒的动态关系研究

目的考察嗜酸乳杆菌在添加Na2SeO3的MRS培养基中的生长与富硒的关系和规律.方法以未添加Na2SeO3的MRS培养基的对照相比.结果加硒培养基中嗜酸乳杆菌生长较为缓慢,生长的延滞期增加,对数期缩短.结论处于延滞期的嗜酸乳杆菌细胞对硒的吸收作用比较强,富硒量迅速增加至最高达62.054 μl/g菌细胞.     

一株多菌灵降解细菌的分离、鉴定及系统发育分析

从被多菌灵污染的湖南红壤土中分离到一株能以多菌灵为唯一碳源和能源生长的菌株1_1,该菌在含酵母膏多菌灵(500mg/L)的无机盐培养基中与无酵母膏的多菌灵(500mg/L)无机盐培养基中,24d对多菌灵的降解率分别为95.56％和19.6％。根据表型特征、G+C含量及16S rDNA序列分析将菌株1-1鉴定为β-Proteobacteria中的Ralstonia sp.（罗尔斯通氏菌）。     

3-苯氧基苯甲酸降解菌的分离及降解特性研究*

从农药厂污泥中分离到一株3-苯氧基苯甲酸(3-Phenoxybenzoicacid,3-PBA)降解菌PBM11。经生理生化试验和16SrDNA测定初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonassp·)。PBM11能以3-PBA为唯一碳源生长,降解试验表明:在基础盐培养基中,初始pH7·0,30℃,160r/min,装瓶量为100mL/250mL的条件下,PBM11经过24h可完全降解200mg/L的3-PBA;添加低浓度的外源营养物质能够在一定程度上促进降解;Cu²⁺和     

产顺式环氧琥珀酸水解酶的红球菌M1菌株的分离鉴定及其产酶条件优化

从土壤中筛选到一株产顺式环氧琥珀酸水解酶（ESH）的菌株,经生理生化、Biolog碳源利用试验和16S rDNA序列分析系统发育研究,菌株可能为赤红球菌(Rhodococcus ruber) M1。摇瓶试验确定了最佳碳源、氮源、顺式环氧琥珀酸二钠添加时间和添加量。正交优化试验的最佳培养基和培养时间为：葡萄糖12%,硫酸铵06%,酵母膏05%;顺式环氧琥珀酸二钠投加时间为30h,投加量为358%;菌体培养时间70h。摇瓶试验ESH酶活达750U/g湿细胞。目前该菌株已经应用于固定化细胞连续生产L(+)酒石酸。     

培养基及其组成对水母雪莲悬浮培养细胞生长及黄酮形成的影响

8种不同的基本培养基对水母雪莲(Saussurea medusa)细胞生长和黄酮形成的影响不同。实验结果表明,MS培养基较有利于细胞生长和黄酮形成。从MS培养基修饰得到的MG和MP培养基比前者细胞生长量与黄酮产量分别提高32%和70%。碳源、氮源、植物激素对细胞生长及黄酮形成的影响较为明显。用HPLC对细胞培养物中两种有效黄酮(Jaceosidin和Hispidulin)作了定性定量分析。     

青霉PT95菌株固态发酵产生类胡萝卜素的研究

本文对青霉Penicillium sp. PT95菌株在固态发酵条件下菌核内产生类胡萝卜素进行了初步研究。结果表明,在3种固态发酵培养基中,玉米粉培养基(SMA)比麸皮培养基和棉籽壳培养基更适合于PT95菌株固态发酵产生类胡萝卜素。为了增加菌核干重和提高类胡萝卜素产率,SMA中需要添加氮源、碳源和植物油。在所试的各种氮、碳源中,以硝酸钠和麦芽糖效果最佳。通过正交试验确定了在培养基盐溶液中添加硝酸钠3g/L,麦芽糖10g/L,豆油2.5g/L能使菌核干重由536g/100g提高到970g/100g(干料);类胡萝卜素产率由2149μg/100g提高到5260μg/100g(干料);β-胡萝卜素在类胡萝卜素中的含量由614%提高到71.3%。     

利用高通量生物反应器优化一种CHO细胞无血清培养基

研究以DMEM/F12(1:1 V/V)培养基为基础,添加不同添加剂优化一种适宜CHO DG44细胞生长的廉价培养基。以细胞密度和细胞活率为主要指标,对DMEM/F12(1:1 V/V)培养基进行了优化。通过正交试验和单因素试验筛选出了CHO DG44细胞生长的最佳培养基。正交试验结果表明添加8mg/L Insulin、10mg/L Transferrin、12mM Glutamine、9mg/L Ethanolamine、9mg/L Sodium selenite、0.5×Lipids、0.5×Vitamin,对细胞生长有较好促进作用,细胞密度从0.6×106 cells/mL上升到1.8×106 cells/mL。在此基础上添加2.5g/L Malt Peptone和2.5g/L YeastExtract可使细胞密度达到2.65×106 cells/mL,基本上达到商业培养基的培养效果,而成本降低了约60%。     

渗透压调控对裂殖壶菌发酵产DHA的影响

考察了不同渗透胁迫(0、10、20、30和40 g/L NaCl)对裂殖壶菌HX-308发酵产DHA及脂肪酸构成的影响。结果表明:20 g/L NaCl最有利于裂殖壶菌生长和DHA积累,生物量、总脂肪酸含量、DHA产量及DHA占生物量的比值分别为73 g/L、10.7 g/L、5.0 g/L和68 mg/g,并且DHA在总脂肪酸中所占百分比最高,为45.2%。此外,在低渗透压(10 g/L NaCl)条件下,添加40 mmol/L甘氨酸甜菜碱,DHA产量与未添加相比提高了28.21%;在高渗透压(40 g/L NaCl)条件下添加40 mmol/L海藻糖,DHA产量提高了46.84%;表明添加适量的外源相容性溶质能有效地促进裂殖壶菌积累DHA。     

不同浓度有机物对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响

以NT为基本培养基,雷公藤(Tripterygium wilfordii)不定根为材料,研究了肌醇、VB1、烟酸、VB6、甘氨酸、叶酸、生物素等有机物质对雷公藤不定根生长及其次生代谢产物雷公藤甲素和总生物碱含量的影响。结果表明:NT培养基中原有浓度的肌醇、VB1含量即可使雷公藤不定根生长量、雷公藤甲素含量、总生物碱含量及产量达到最大值。在添加的其他有机物中,添加1 mg/L烟酸、1 mg/L VB6和5 mg/L甘氨酸适合不定根的生长;添加0.5 mg/L烟酸、0.5 mg/L生物素、1 mg/L VB6、1 mg/L甘氨酸和1 mg/L叶酸适合雷公藤甲素的积累;添加0.5 mg/L甘氨酸、1 mg/L VB6、1 mg/L叶酸和1 mg/L生物素则适合不定根中雷公藤总生物碱的合成。     

人三叶因子3在毕赤酵母中表达条件的研究

为提高人三叶因子 3 (HumanTrefoilfactor 3 ,hTFF3 )在毕赤酵母中的表达量 ,研究了转化子生长的培养条件 ,包括不同碳源对转化子生长的影响和接种量、甲醇浓度、pH值、摇瓶转速及不同诱导时间对人三叶因子 3表达的影响。结果表明转化子在生长阶段加入葡萄糖生长旺盛 ,培养 14h后OD₆₀₀ 就可达到 50。在 100mL生长培养基上的菌液以 1∶1接入诱导培养基时蛋白表达量最高 ;转化子在 1%的甲醇、pH60、摇瓶转速240r/min的条件下诱导4 8h ,菌体密度OD₆₀₀为 15 ,目的蛋白表达量达到 20mg L。用 5L发酵罐进行了高密度发酵 ,经2%甲醇32h诱导 ,最终菌体密度OD₆₀₀ 达到 120 ,每升发酵液中含目的蛋白100mg。     

人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达

在P.pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体（HBscFv）。设计引物从pGEMHBscFv上扩增目的基因,亚克隆至P.pastoris表达载体pPICZαA中,线性化后转化P. pastorisGS115;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现,重组HBscFv可以在α因子的引导下,分泌至培养基中,产量为80mg/L;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性,活性总量在诱导培养72h后达最高峰,在诱导培养后期,HBscFv活性下降;PAS糖显色结果表明,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。     

山菠菜胆碱单氧化物酶基因(CMO)的克隆与分析

甜菜碱是一类广泛存在于生物体内的渗透保护剂。高等植物中,甜菜碱的生物合成经由胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱两步反应完成,其中第一步反应,也是甜菜碱生物合成的限速反应,由胆碱单氧化物酶(CMO)催化。本研究以耐盐植物山菠菜(Atriplex hortensis)为材料构建了盐胁迫下的cDNA文库,用菠菜CMO cDNA为探针从中筛选获得一个长1.77kb的cDNA克隆,测序结果表明该克隆包含一个完整的开放读码框,编码一个由438个氨基酸构成的多肽,与菠菜和甜菜CMO的氨基酸序列同源性分别为81%和72%。同菠菜和甜菜中的CMO序列相比,山菠菜CMO基因(AhCMO)也具有保守的RieskeType［2Fe2S］簇结合区和保守的多铁原子核结合域。对盐处理条件下山菠菜CMO基因转录水平的研究表明CMO基因在盐胁迫情况下表达量增加约3倍。将CMO与35S启动子连接后转化烟草(Nictiana tabacumvar.Xanthi),获得了具有一定耐盐性状的转基因植株,在1.2%NaCl的盐浓度下生长良好。