康乐霉素C产生菌的微波诱变

以物理因子微波对免疫抑制剂康乐霉不C的产生菌进行了菌种诱变,研究了微波处理的条件、照射的时间及剂量,获得康乐霉素C生产能力高于出发菌株180%的M-13-21。     

S-丙二酰转移酶基因失活对地中海拟无枝酸菌产利福霉素的影响

为提高利福霉素的产量,构建了S-丙二酰转移酶基因失活的地中海拟无枝酸菌。利用融合PCR构建S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,通过电击转化导入到地中海拟无枝酸菌中,使之发生同源重组,以安普霉素为标记,筛选了S-丙二酰转移酶基因失活菌株,并对比了突变菌株与原始菌株的利福霉素SV产量。成功构建了S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,获得了地中海拟无枝酸菌突变株A.mediterranei △fab D,失活菌株的利福霉素SV产量为168.08 mg/L,比原始菌提高了9.94%。S-丙二酰转移酶基因的失活,弱化了突变菌株脂肪酸的合成,强化了利福霉素的合成。     

发酵条件优化及基因簇加倍对厦门霉素生物合成的影响

【目的】优化发酵培养条件及加倍xim基因簇,提高厦门霉素的产量。【方法】采用单因素添加:C源(鼠李糖、葡萄糖酸)、无机N源(KNO3)、稀有金属元素(Sc Cl3)及A-Factor(γ-丁内酯),优化适宜厦门链霉菌318菌株产生厦门霉素的培养条件;通过位点特异性整合将厦门霉素生物合成基因簇进行加倍,构建高产的基因工程菌株厦门链霉菌318Pls1,并对其培养基进行了正交实验优化。【结果】与初产量(15 mg/L)相比,在GYM培养基中进行单因素添加可使318菌株的厦门霉素产量达到20 mg/L;而基因簇加倍菌株318Pls1在GYM培养基上的厦门霉素产量可达35 mg/L,在正交实验优化后的9#培养基中厦门霉素产量可达76.15 mg/L。【结论】对厦门霉素的发酵培养条件进行了优化,并通过基因簇过表达获得了生物合成能力提高的菌株,为进一步提高其产量奠定了基础。     

紫外诱变选育恩拉霉素高产菌株

本研究采用紫外诱变育种技术对一株产恩拉霉素抗真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)F110进行了诱变处理,经链霉素抗性、利福霉素B抗性以及双重抗性筛选,共获得了132株抗生素抗性突变株,其中26株突变菌株的恩拉霉素产量与出发菌株相比均有明显提高。摇瓶发酵条件下,突变株SR93的恩拉霉素产量最高可达2 400μg/m L,与出发菌株相比提高了38%。传代结果表明:该突变株产素水平稳定,因此具备较好的开发及工业应用价值。     

谷氨酰胺高产菌株的定向选育研究

采用谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株,经γ-射线—硫酸二乙酯—γ-射线诱变,磺胺胍抗性筛选后,定向选育出1株高产菌株SH77。在适宜的条件下积累谷氨酰胺平均为38.9g/L,最大达39.3g/L,比出发林提高了3.81倍。该菌株在最优化代谢控制发酵工艺条件下,谷氨酰胺产量最高达56.2g/L。     

钴60诱变选育平菇新菌株的研究

【目的】利用~(60)Co-γ射线诱变平菇原生质体创制平菇新种质。【方法】通过3个剂量的~(60)Co-γ射线辐照处理平菇原生质体悬浮液,统计不同剂量的致死率,利用拮抗试验、SSR分子标记筛选突变菌株,通过出菇试验筛选优良的平菇新菌株。【结果】平菇原生质体在0.9 KGy的诱变处理下致死率为0%,在1.2KGy的诱变处理下菌株致死率63.33%,在1.5KGy的诱变处理下菌株致死率为76.67%。经拮抗试验和SSR分子标记筛选,获得了8株突变菌株,出菇试验结果表明7个突变菌株产量和生物学效率均有不同程度的降低,菌盖颜色也略有变化,其中突变菌株1.5-P4的产量较对照降低了41.92%;而突变菌株1.2-P1为高产菌株,其产量达437.95±12.22 g/袋,较对照菌株提高了9.76%,生物学效率较CK提高了10.38%。【结论】利用~(60)Co-γ射线诱变育种技术得到了1个性状较为优良的平菇新菌株,这为其他食药用菌诱变育种研究提供了参考。     

大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌

以白色链霉菌Z-18为出发菌株,经大剂量紫外诱变处理,用S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸（AEC）氨基酸结构类似物平板定向育种方法,获得1株ε-聚赖氨酸高产菌C-18,其发酵液中ε-聚赖氨酸产量较出发菌株提高42．9％。在含有50g／L葡萄糖的培养基中,ε-聚赖氨酸积累可达1．23g／L。     

谷胱甘肽高产菌株的选育

以编号为 346的酿酒酵母为出发菌株 ,通过紫外线和_{60Coγ射线诱变处理 ,运用推理育种技术 ,选育到一株抗氯化锌和乙硫氨酸的突变株 0 5Eth40 0 5。该菌株经摇瓶发酵谷胱甘肽产量为 1 65 96mg L ,较出发株提高 350 % ,每克干细胞含谷胱甘肽 1 9 76mg ,较出发株提高 31 8 6 %。菌株经 1 0次传代培养 ,谷胱甘肽产量下降 1 0 7% ,是一株性状较稳定可深入开发研究的优良菌株。}     

高产γ-氨基丁酸低产桔霉素红曲霉(Monascus ruber)突变子1047筛选与发酵特性研究

以红曲米中筛选到的红色红曲霉菌株G为原始菌株,通过农杆菌介导T-DNA插入突变技术,成功构建了含有1 483株红曲霉突变子的T-DNA插入突变库。用HPLC等方法从突变库中筛选出10株γ-氨基丁酸(GABA)产量稳定高于原始菌株G的突变子,薄层层析结合HPLC技术分析了10株突变子发酵液中桔霉素的含量;其中突变子1047的GABA产量较高,为1.169g/L,是原始菌株G(GABA产量0.472g/L)的247.67%,桔霉素含量稳定低于原始菌株G。以红曲霉菌株G和突变子1047为实验材料,通过5 L发酵罐发酵并定时取样,HPLC等方法精确分析发酵液各种活性物质的含量;结果显示,突变子1047生长速度稍快于原始菌株G;GABA、莫纳可林K(Monacolin K)、红曲色素色价分别为2.201 g/L、83.892 mg/L、21.984 U/mL,是原始菌株G的279.67%、108.01%和182.35%;而桔霉素产量为1.976 mg/L,是原始菌株G的41.71%。因此,利用TDNA插入的方法对红曲霉进行育种,能产生稳定的遗传变化,在红曲霉资源的保护和利用上有一定潜力。     

恩拉霉素生产菌株的遗传改造

【目的】提高杀真菌素链霉菌发酵生产恩拉霉素的产量。【方法】利用定点突变技术,对恩拉霉素生产菌株杀真菌素链霉菌F1中影响细胞次级代谢及抗生素合成的核糖体S12蛋白的编码基因rps L进行改造,将第43位的赖氨酸(Lys)分别替换为天冬酰胺(Asn)和精氨酸(Arg),并对改造菌株L-M1(Asn43)和L-M2(Arg43)的生长特性、抗生素合成以及摇瓶发酵性能进行研究。【结果】与野生型菌株相比,改造菌株的生长特性及生理生化特性均发生了明显的改变:产孢周期明显缩短,野生型菌株在MS培养基中,28°C下需要培养5-7 d后才能产生孢子,而在相同条件下,改造菌株3 d后就能产生大量的孢子;恩拉霉素产量相对提高,摇瓶发酵条件下,改造菌株L-M1(Asn43)和L-M2(Arg43)的恩拉霉素产量分别可达到1 334 U/m L和1 456 U/m L,与野生型菌株F1相比分别提高了11.9%和22.1%。【结论】通过遗传改造,恩拉霉素的产量得到了提高,为其他位点的遗传改造提供了可行性。     

异源表达afsRScla全局性调控基因提高工业菌株纳他霉素产量

前期研究表明棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla异源表达可以激活变铅青链霉菌中两种抗生素的合成。本研究将包含afsRScla基因的质粒pHL851整合到纳他霉素工业生产菌株褐黄孢链霉菌TZ1401的基因组中,使纳他霉素产量提高38%,达到3.56g/L。qRT-PCR检测6个纳他霉素生物合成基因的转录情况,发现其转录水平提高1.9-2.7倍,表明afsRScla通过正调控纳他霉素生物合成基因的转录,从而提高纳他霉素的产量。本研究结果对afsRScla在抗生素工业生产菌株的高产育种应用具有借鉴意义。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶对埃博霉素生物合成的影响

【目的】研究S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)对埃博霉素生物合成的影响。【方法】通过向发酵培养基中添加抑制剂和促进剂,比较分析纤维堆囊菌中SAMs的活性变化以及埃博霉素的产量变化。【结果】在埃博霉素的合成期,SAMs的活性较高。加入抑制剂吲哚乙酸(IAA)之后,SAMs的活性和埃博霉素的产量都不同程度的降低,而加入促进剂对甲苯磺酸钠(p-TSA-Na)之后,SAMs的活性和埃博霉素的产量在不同程度上都有提高。在纤维堆囊菌的次级代谢中,SAMs活性与埃博霉素的生物合成量呈正相关。【结论】S-腺苷甲硫氨酸合成酶在纤维堆囊菌的埃博霉素生物合成过程中发挥了重要的作用。     

木霉纤维素酶高产变异菌株9023的选育

1.用γ-射线、甲基磺酸乙酯和亚硝基胍反复处理木霉野生菌株1323,选得变异菌株9023,纤维素酶产量提高两倍以上。 2.这几种诱变因素对提高木霉纤维素酶产量的作用,甲基磺酸乙酯和亚硝基胍的效果甚好,而γ-射线效果甚差。     

紫外线和60Co辐照诱变选育高效嗜酸氧化亚铁硫杆菌

依次利用紫外线和60Co-γ射线辐照诱变的方法对嗜酸氧化亚铁硫杆菌进行诱变,选育高效嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株.结果表明,紫外诱变可以有效提高嗜酸氧化亚铁硫杆菌的Fe2+氧化速率,最佳紫外线诱变时间为240 s.诱变后菌株的Fe2+氧化速率从0.273 g/L/h提高到了0.312 g/L/h.继续利用60Co-γ射线进行...     

氮离子注入选育阿维拉霉素高产菌株的研究

以提高产绿链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)SV-1产阿维拉霉素(Avilamycin)产量为目的,采用低能氮离子注入技术,辅之以链霉素抗性筛选法进行诱变选育研究。结果表明,“马鞍”区域即注入剂量范围在3×10~(15)～5×10~(15)ions/cm~2诱变效果最佳,菌株的抗药性突变与产量突变密切相关,链霉素抗性筛选法具有可行性。在摇瓶条件下,最终获得稳定性良好,阿维拉霉素产量达到83．5mg/L,较出发菌株提高195%的突变株SVT-45。实验表明,离子注入技术是一种有潜力的微生物诱变育种新方法。     

透明质酸生产菌的诱变选育

以马链球菌为出发菌株, 通过紫外线和60Co-γ射线辐照诱变, 得到一株无溶血性菌株NC1150, 并在此基础上继续用60Co-γ射线辐照诱变得到产量较高的菌株NC168, 使透明质酸产量与出发菌株NC1150相比提高了101%, 相对分子量为0.55×106 D, 突变株经过多次传代, 透明质酸产量和相对分子量保持稳定, 溶血性无回复突变现象。     

抗性基因报告系统辅助选育厦门霉素A高产菌株

【背景】厦门霉素A是厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis) 318菌株的主要次级代谢产物,具有显著的抗纤维化活性及药用潜力。但野生型菌株中厦门霉素A的产量仅有14 mg/L,其生产水平亟待提升。【目的】通过随机诱变-抗性标记筛选获得高产菌株并进行培养基优化,以提高厦门霉素A的产量。【方法】在厦门霉素A的生物合成基因簇后融合一个抗性基因,用于报告整个基因簇的表达水平。对构建的基因工程菌株进行常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变,从抗性水平高的突变菌株中筛选高产菌株,并通过培养基优化,使厦门霉素A产量显著提升。【结果】构建携带卡那霉素抗性标记的产厦门霉素A的工程菌MT-XN作为出发菌株,对该菌株进行一轮ARTP诱变,使用90 mg/L卡那霉素筛选,得到了厦门霉素A产量为101.7 mg/L的突变菌株MA-8。进一步通过响应面法优化培养基配方,在最佳培养基中MA-8菌株产生的厦门霉素A达到134.2 mg/L,较野生型菌株提高了845.1%。【结论】采用随机诱变-报告基因筛选系统,可快速筛选出厦门霉素A产量大幅提升的高产菌株,为后续的药物开发奠定良好的基础。     

高产莫纳可林K低产桔霉素红曲霉菌株的筛选和发酵条件初步优化

采集全国各地红曲霉制品中的红曲霉资源,经分离获278株红曲霉菌株。高效液相色谱(HPLC)法测定各菌株发酵液中莫纳可林K(Monacolin K)和桔霉素含量,筛选获1株Monacolin K产量较高、桔霉素含量较低的红曲霉菌株编号为M-22。依据形态特征和ITS基因序列,参照红曲霉属分类检索表,鉴定M-22菌株为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。通过摇瓶发酵对温度、初始pH、碳源、氮源、碳氮比(C/N)等因素进行优化,确定M-22菌株摇瓶发酵产Monacolin K适宜条件为发酵温度26℃、初始pH 5.0、转速160 r/min,甘油为碳源、蛋白胨为氮源、碳氮比(C/N)为5:1,Monacolin K产量显著提高,最高为107.16 mg/L。以优化的发酵条件对M-22菌株进行5 L发酵罐发酵,发酵液中Monacolin K产量最高为189.83 mg/L,桔霉素含量32.53μg/L,红曲色素色价为16.38 U/m L。     

小克银汉霉γ-亚麻酸高产菌株的快速筛选和发酵条件研究

以小克银汉霉C0为出发菌株,经过5-氟尿嘧啶和紫外线复合诱变,采用抗失水苹果酰肼与抗低温(15℃)相结合的筛选方法,获得一株生产性能比出发菌株显著提高的突变株C23。采用5L全自动发酵罐对小克银汉霉C23发酵生产γ-亚麻酸的pH值控制和补料工艺进行研究,发现将发酵液pH值维持在5.5,当发酵进行到60h、84h、108h时,分别补糖15g/L,发酵192h后收获,结果生物量、油脂产量和γ-亚麻酸产量分别达到49.88g/L、21.93g/L、2.69g/L。     

Bacillus amyloliquefaciens C1菌株γ-PGA合成基因pgsBCAE的克隆与表达

γ-PGA是微生物合成的一种新型高分子生物可降解材料,基因工程菌株的构建对于其合成机理及开发生产具有较高的研究价值。利用Self-Formed Adaptor PCR(SEFA-PCR)方法扩增出菌株B.amyloliqueficiens C1的γ-PGA合成酶基因簇pgs BCAE,将其克隆到表达载体p ET29a(+)中并转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)。结果表明,转化所得的工程菌株在IPTG诱导下通过摇瓶发酵生产0.14 g/L的γ-PGA。Mn2+和Zn2+能够显著促进重组子E.coli BL21(p ET29α-pgs BCAE)发酵合成γ-PGA的产量,并且这种促进作用随着Mn2+和Zn2+浓度的提高而越加显著。Mg2+在低浓度(1 mmol/L)下也促进重组子合成γ-PGA,之后随着Mg2+浓度的升高,这种促进作用逐渐减弱,当Mg2+浓度达到4 mmol/L时,反而抑制重组子γ-PGA的合成。菌株B.amyloliqueficiens C1基因组内含有完整的γ-PGA合成酶基因簇pgs BCAE,该基因簇能够在表达宿主E.coli BL21中被诱导表达并合成γ-PGA,且其γ-PGA的合成受金属离子的影响。