油葵种子特异启动子Ha ds10 G1的克隆及功能鉴定

从油葵中克隆得到LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因的启动子序列,并对其进行功能分析。利用PCR技术从油葵品种"矮大头"基因组DNA中分离Ha ds10 G1基因上游的调控序列,将其与GUS基因融合,构建种子特异性表达载体p BI121-PHa ds10,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89,对再生植株进行PCR、RT-PCR和GUS组织化学分析,以检测GUS基因在转基因烟草中的表达情况。结果表明,油葵Ha ds10 G1基因启动子长度为1 417 bp,与已报道的向日葵Ha ds10G1基因启动子序列同源性为89.42%。作用元件分析发现该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如RY重复元件、ABRE元件、TC-rich元件等。转基因植株的PCR结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,该启动子序列仅能够驱动GUS基因在烟草种子表达,而在根、茎、叶等组织中均未检测到GUS基因表达。因此,油葵LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因上游1 417 bp片段具有种子特异性启动子功能。研究结果为油葵等油料作物的油脂遗传改良提供组织特异性启动子。     

天麻抗真菌蛋白基因的克隆及其启动子活性

通过构建和筛选天麻（Gastrodia elata Bl)基因组文库,克隆了一个天麻抗真菌蛋白基因组DNA。该基因组DNA含有一个516碱基组成的编码区。没有内含子结构。其启动子区含有保守的TATA盒及CAAT盒。为研究启动子活性。构建了-1157bp启动子区与GUS基因的融合表达载体。并将其用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法导入烟草（Nicotiana tabacum)中,获得了稳定转化的烟草。利用荧光检测及组织化学染色法对GUS表达进行了分析。结果表明,该启动子能够启动GUS基因在转基因烟草中组织特异性地表达。GUS基因在根中的表达水平最高。茎中次之,叶中只有低水平表达,而且该启动子具有诱导表达活性。可被真菌及水杨酸,茉莉酸强烈诱导表达。     

天麻抗真菌蛋白基因的克隆及其启动子活性

通过构建和筛选天麻(Gastrodia elata Bl.)基因组文库,克隆了一个天麻抗真菌蛋白基因组DNA.该基因组DNA含有一个516碱基组成的编码区,没有内含子结构.其启动子区含有保守的TATA盒及CAAT盒.为研究启动子活性,构建了-1 157 bp启动子区与GUS基因的融合表达载体.并将其用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法导入烟草(Nicotiana tabacum)中,获得了稳定转化的烟草.利用荧光检测及组织化学染色法对GUS表达进行了分析.结果表明,该启动子能够启动GUS基因在转基因烟草中组织特异性地表达.GUS基因在根中的表达水平最高,茎中次之,叶中只有低水平表达.而且该启动子具有诱导表达活性,可被真菌及水杨酸、茉莉酸强烈诱导表达.     

拟南芥根特异表达基因启动子在烟草中的表达

以拟南芥为材料,利用PCR技术分离pyk10启动子序列,构建了该启动子GUS植物表达载体,农杆菌介导转化烟草,分析该基因在烟草中的表达,以明确拟南芥根特异表达基因pyk10启动子在烟草中的表达特性.结果表明:克隆的pyk10启动子与已报道的pyk10启动子一致性为100%,GUS基因在烟草的根部特异表达,表明该启动子为根部特异表达启动子,为揭示植物根的发生、分化和发育机制,以及培育抗根部病虫害和营养高效利用型转基因烟草奠定了基础.     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达

以玉米(Zea mays L.)黄化苗为材料,利用PCR技术扩增了玉米19kDa醇溶贮藏蛋白基因(zein)起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的-1～-694片段具有19kDa zein启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达90％以上。将此启动子插入pPKGT的GUS基因及NOS终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草(Nicotiana tabaccum Var.samsum),得到了转化植株。转化的烟草的PCR扩增及Southern杂交证明目的片段已整合到烟草基因组中。转基因植株的GUS活性检测表明,在叶、根中无GUS活性,GUS活性只存在于种子中。转基因植株烟草种子经冷冻切片,GUS底物Xgluc活体组织染色证明GUS活性只存在一层介于种子胚乳与种皮之间的细胞中。     

拟南芥冷诱导型启动子CBF 3的克隆及活性检测

目的：构建冷诱导型启动子CBF3基因的植物表达载体,并将其转入烟草。方法：以拟南芥基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆冷诱导表达启动子CBF3（C-repeat binding factor）。用CBF3启动子替换pBI121载体上的35S启动子构建新的载体pBC-GUS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。结果：获得了转基因烟草,转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明,在低温诱导下,CBF3启动子可增强GUS基因表达。结论：CBF3启动子可应用于植物抗冷基因工程研究。     

芥菜型油菜BjuA09DFR基因及其启动子的克隆与转化和表达

该研究利用实时荧光定量(qRT-PCR)检测了BjuA09 DFR基因的时空表达特异性,并通过克隆BjuA09 DFR基因启动子片段,构建该基因的启动子GUS融合表达载体,利用农杆菌介导法将重组质粒转入野生型拟南芥,最后对拟南芥转基因材料不同发育时期的不同组织部位进行GUS组织化学染色,分析BjuA09 DFR基因启动子的表达模式,为BjuA09 DFR基因启动子功能的进一步研究提供理论依据。结果表明:(1)BjuA09 DFR基因在芥菜型油菜的多个组织部位都有表达,尤其是在叶、花、角果和授粉后15d种子中表达量较高。(2)成功构建了BjuA09 DFR基因启动子和GUS基因融合表达载体(pBjuA09 DFR∷GUS),采用农杆菌介导法将重组质粒转入野生型拟南芥,经卡那霉素筛选和PCR检测抗性苗,获得转基因拟南芥阳性苗。(3)GUS组织化学分析结果显示,转基因拟南芥材料的GUS活性具有明显的时空特异性,在叶、花、角果和种子中的染色较深,具有很强的GUS活性。     

玉米淀粉分支酶基因启动子的克隆与功能分析

以玉米品种“吉糯1号”的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到玉米淀粉分支酶基因的启动子序列,克隆到pMD18-TVector上,经测序,该启动子大小为934bp。与已报道的序列比较仅有14个核苷酸发生改变,同源性为98.5%。用该启动子取代植物表达载体pBI121的35S启动子,与GUS基因编码区连接,构建成融合质粒pSBE-GUS。经农杆菌介导法转化烟草,获得了转基因植株。GUS活性检测结果表明,由该启动子序列引导的GUS基因能在种子中表达,而在其他组织中表达微弱或未表达,证实该启动子具有种子特异性表达的功能。     

ocs/mas|一个受损伤和植物激素诱导的嵌合启动子的构建与功能分析

选择适宜的转录调控序列以提高启动子的转录效率,增强外源基因在转基因植株中的表达,对改良作物的抗病虫性具有重要意义。将甘露碱合成酶基因(mas)启动子和章鱼碱合成酶基因(ocs)增强子杂合而成的嵌合启动子ocs/mas与GUS报告基因连接,构建了植物表达载体pOMS-GUS。对照载体pMAS-GUS仅携带mas启动子驱动的GUS基因。利用根癌农杆菌介导法,将以上植物表达载体分别转化烟草。应用半定量RT-PCR和GUS荧光定量分析法分别检测不同胁迫条件下启动子驱动的GUS基因表达量的变化。结果显示,未诱导处理的转基因植株GUS基因仅有微弱表达。伤害处理1h后,mas启动子驱动的GUS活性是未诱导处理的1.8倍,而嵌合启动子ocs/mas的诱导表达活性是未处理的5.7倍。植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)处理也诱导了较高水平的ocs/mas嵌合启动子活性;而且SA和MJ联合作用时呈现叠加效应,转基因烟草的GUS活性明显高于伤害处理后的GUS表达水平。以上结果表明,ocs/mas嵌合启动子是一种强诱导型启动子,可以接受多种刺激因子的诱导,从而为更有效地改良作物抗病虫的能力提供新的候选高效启动子元件。     

玉米茎特异启动子克隆及其在转基因烟草中的活性分析

从玉米自交系‘综31’基因组中分离了1个茎特异表达启动子,命名为ZmSSP。用ZmSSP替换植物表达载体pCAMBIA3301的CaMV35S启动子,构建了ZmSSP驱动GUS报告基因的重组表达载体pCAMBIA3301-ZmSSP-GUS,并采用农杆菌介导法转化烟草,对转基因烟草营养器官中GUS表达模式进行了分析。结果表明:在烟草中ZmSSP活性低于CaMV35S启动子;不同转基因株系中ZmSSP活性及模式有显著差异;10个转基因株系统计结果表明,GUS表达量最高的营养器官是叶柄,平均是Actin基因表达量的2.71倍;其次是叶片和茎,在根中的GUS表达量最低,平均是Actin基因表达量的29.6%,是叶柄中活性的10.9%。研究认为,ZmSSP是较好的组织特异性启动子,适用于通过植物基因工程技术驱动目的基因进行地上营养器官的性状改良。     

玉米Ubi－1启动子在可育转基因玉米植株中的表达活性

本工作将玉米泛素基因－1启动子（Ubi-1)与大肠杆菌β－葡萄糖苷酸酶基因（gus,uidA)的编码区融合,通过基因枪粒子轰击方法转化来自水成熟胚盾片组织的I－型愈伤组织,经PPT选择获得可育的玉米转基因植株,并采用组织化学方法分析了Ubi-1启动子驱动的gus基因在不同组织,细胞中的表达活性,发现gus基因在除花药壁以外的其它所试组织中均可以有效表达。Ubi：GUS在花粉,卵细胞中T1代转基因植株未成熟胚中的表达显示该启动子在植株发育的早期阶段即具有活性。对T0代转基因植株的花粉进行GUS组织化学染色,gus基因呈1：1分离,显示外源基因在转基因植株中以孟德尔方式遗传。同时发现,使用玉米本身的启动子Ubi-1可以降低外源基因在转基因玉米中的拷贝数,进而避免基因沉默现象的发生。目前已得到第二代转基因种子。     

拟南芥atslA基因启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出atslA基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,atslA基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。     

用无启动子的GUS报告基因捕获水稻基因启动子

构建了嵌合质粒p13DGUTs,它是在Ds转座子中插入了无启动子的B．葡萄糖醛酸酶报告基因(GUS),用于分离水稻基因启动子。将p13DGUTs转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,获得了496个转基因植株。抗性愈伤组织与转基因植株的GUS染色与PCR分析表明整合在水稻染色体上的Ds因子都发生了随机跳跃。转基因植株T0代与部分T1代的GUS染色结果表明,M92转基因植株中Ds转座子整合位置上游的水稻基因启动子指导GUS基因的表达及表达的特性是可遗传的。文章对此方法在分离水稻基因启动子与基因上的应用进行了讨论。     

拟南芥ats1A基因启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出ats1A基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,ats1A基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。     

番茄rbcS3A启动子控制的GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究不同启动子用于转基因水稻,克隆了番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游调控区,构建了由rbcS3A启动子引导的GUS嵌合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS3A启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶组织中高效表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。在转基因水稻中,番茄rbcS3A启动子驱动外源基因的表达不受光诱导。     

竹节花黄斑驳病毒启动子的缺失分析及功能

竹节花黄斑驳病毒(CoYMV)是侵染单子叶植物竹节花的一 种双链环状DNA病毒,它的启动子可介导外源基因在烟草韧皮部特异表达。为了研究其组织 特异性表达的最佳启动子区域,对CoYMV启动子进行了5′端五种不同长度的缺失分析,用不同长度的启动子片段与GUS基因及NOS3′端转录中止序列构建了全长启动子及5 个缺失启动子序列的六个嵌合GUS基因植物表达载体。利用农杆菌将上述嵌合基因转化烟草 外植体后,每种表达载体都获得了一批转基因烟草植株。转化再生烟草植株的PCR分析、GUS 酶活测定及GUS组织染色的结果表明六种类型的嵌合基因已整合到烟草染色体中,并有五种 表达出GUS活性。缺失到870bp的启动子比全长启动子(1040bp)的活性约高78%,870bp比585bp启动子介导的GUS活性略高但差别不明显,缺失到447和232时GUS活性有明显下 降,但仍具有韧皮部特异表达的特性。当缺失到TATA box附近的44bp时启动子丧失组织特 异性,GUS活性也降低到测不出来的水平。以上结果表明CoYMV启动子从转录起始位点上游 870bp～230bp及232bp下游区分别与启动子的活性和韧皮部组织特异性密切相关,870bp上游可能存在一个负调控序列,所以该启动子的活性和组织特异性的最佳调控区应在87 0bp或585bp的下游区。CoYMV启动子与35S启动子驱动GUS基因在烟草中表达的活性相比, 前者为后者的70%左右,考虑到前者仅在韧皮部细胞表达而后者为组成型表达,所以CoYMV启 动子在韧皮部的活性可能与35S启动子相当或更高。CoYMV启动子在其它转基因植物中驱动外 源基因表达的特点正在研究中。     

麻疯树curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析

核糖体失活蛋白是一类可以使核糖体28S rRNA的保守α茎环结构域脱嘌呤的蛋白质。麻疯树毒蛋白（curcin）前体基因编码麻疯树胚乳I型核糖体失活蛋白。从麻疯树基因组中克隆得到其5＇侧翼区0.6 kb长的片段,将该片段插入pBI121载体置换其中的CaMV 35S启动子并在相应的转基因烟草中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现,该0.6 kb长的片段能够启动报告基因在种子中的表达,并且其在种子不同发育阶段的表达活性存在差异。同时,GUS组织化学染色定位分析表明,在双子叶植物中该启动子片段是胚乳特异性表达的,它从心形胚时期开始持续地在烟草的胚乳中发挥启动活性。     

超量表达拟南芥油菜素内酯基因BAS1对烟草维管组织发育的影响

为了研究AtBAS1基因对烟草维管组织发育中的影响,本研究构建了含有杨树维管组织特异启动子pLXM5和植物组成性启动子35S驱动的BAS1基因的植物表达载体,并利用叶盘转化法遗传转化烟草,经PCR和GUS组织化学染色检测筛选获得转基因植株。测量转基因烟草的株高和茎围,发现转pLXM5::BAS1基因烟草茎围比野生型烟草高27.3%;对转基因植株茎部进行切片分析和显微观察,转pLXM5::BAS1基因烟草与野生型烟草相比,韧皮部细胞层数是野生型烟草的2.1倍而韧皮部细胞大小没有明显差异。结果说明,BAS1基因在烟草维管组织发育过程中能够促进韧皮部细胞的分化。     

麻疯树curcin 启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析

核糖体失活蛋白是一类可以使核糖体28S rRNA的保守a茎环结构域脱嘌呤的蛋白质。麻疯树毒蛋白(curcin)前体基因编码麻疯树胚乳I 型核糖体失活蛋白。从麻疯树基因组中克隆得到其5'侧翼区0.6 kb长的片段, 将该片段插入pBI121载体置换其中的CaMV 35S启动子并在相应的转基因烟草中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现, 该0.6 kb长的片段能够启动报告基因在种子中的表达, 并且其在种子不同发育阶段的表达活性存在差异。同时, GUS组织化学染色定位分析表明, 在双子叶植物中该启动子片段是胚乳特异性表达的, 它从心形胚时期开始持续地在烟草的胚乳中发挥启动活性。     

水稻rbcS启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异性表达

为将不同启动子用于转基因水稻的研究,从武运粳8号水稻中克隆了Rubisco小亚基基因(rbcS)的5'上游调控区,构建了由rbcS启动子引导的GUS融合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中.对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片和叶鞘内的叶肉细胞中特异性高效表达,而在茎、根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织与细胞特异性.结果还表明,光诱导处理可明显提高rbcS启动子启动的外源基因的表达量.