卵泡液蛋白质组学2-DE体系的构建与应用

卵泡液是在卵泡形成过程中生成的,作为卵母细胞生长和分化的培养基,直接或间接影响卵母细胞的生育力和发育潜能,其成分非常复杂。本研究通过调整,优化2-DE技术条件,建立了相对稳定的卵泡液蛋白质2-DE技术,获得了卵泡液蛋白质组表达图谱,并用PDQuest软件进行了图像分析,用MALDI-TOF MS鉴定了9个蛋白点,其中有四种为新鉴定的在卵泡液中表达的蛋白质。结果表明,该体系稳定性、重复性好,为进一步开展卵泡液蛋白质组学的相关研究奠定了基础。     

猪卵母细胞蛋白质组双向电泳体系的建立及初步分析

建立了猪(Sus scrofa)卵母细胞蛋白质双向电泳平台,并对裂解液的组成、样品处理、双向电泳程序等相关技术进行优化,得到清晰的微量卵母细胞蛋白质的电泳图谱.利用上述优化后的体系分别对未成熟和成熟的猪卵母细胞进行双向电泳分析,并用ImageMaser软件对图谱进行比对分析.结果表明,电泳图谱上大约有800个左右的蛋白点,其中差异蛋白35个,包括上调蛋白22个及下调蛋白13个.说明基于双向电泳的蛋白质组学可以用于卵母细胞成熟的蛋白表达差异的研究.     

双峰驼卵泡发育过程中卵泡液差异蛋白质组学

为了比较双峰驼卵泡发育过程中卵泡液中差异表达的蛋白质,将卵泡按照直径分为6 类,运用双向电泳技术构建双峰驼卵泡液蛋白质二维凝胶电泳图谱,凝胶经考马斯亮蓝染色后用PDQuest 8. 0 检测差异蛋白,结果表明在6 类大小不同的卵泡中共检测到13 个差异蛋白点,这些蛋白点经LC -MS/ MS 鉴定出7 种不同的蛋白质,它们分别是:血红蛋白、toll-like 受体9、抗凝血酶、聚泛素、γ 纤维蛋白原、重组活化蛋白1 和跨膜与卷曲螺旋域3。基于这些蛋白的功能和表达模式,结合实验结果讨论了这些蛋白质在生殖中的功能,发现toll-like 受体9、聚泛素、γ 纤维蛋白原和重组活化蛋白1 可能与卵泡发育或卵母细胞的成熟有关。这些蛋白质的发现为了解双峰驼卵泡发育和卵母细胞成熟的生理机制奠定基础。     

牛卵母细胞及着床前胚胎发育的蛋白质组学研究进展

蛋白质组学作为一种能够全景式展示特定生物学过程的蛋白质表达谱的高通量研究手段,正被应用到越来越多的研究领域。牛的卵子发生以及着床前胚胎的生长发育都离不开蛋白质的一系列变化,通过蛋白质组学的研究手段可对牛卵母细胞成熟以及胚胎发育分子机制进行研究。前人通过构建成熟前后的卵母细胞或不同时期的着床前胚胎等的蛋白质组表达谱,来获得与卵母细胞成熟相关的标志蛋白,并对这些标志物进行验证和分析,将有利于理解牛卵母细胞成熟、体外受精及着床前胚胎发育的分子机制,为提高牛卵母细胞的成熟率以及胚胎的发育率及提高牛繁殖率等奠定基础。主要从双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、色谱技术以及质谱技术等蛋白质组学研究手段为切入点,对蛋白质组学在牛卵母细胞和着床前胚胎发育过程中的研究进展进行综述,为进一步研究牛卵母细胞及附植前胚胎提供参考。     

处理方式不同的颗粒细胞和卵泡液对牛卵母细胞体外受精后卵裂率和囊胚率的影响

将牛的卵母细胞置于添加有不同预处理颗粒细胞及含有卵泡液的培养液或不舍有卵泡液的培养液中进行体外成熟、受精及胚胎发育培养,研究了颗粒细胞、卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对牛卵母细胞成熟、受精后卵裂率、囊胚率的影响。2178枚卵母细胞体外成熟受精后胚胎发育的对比观察结果表明：颗粒细胞、卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对卵母细胞成熟受精后胚胎的卵裂具有显著影响（P〈0．05）;颗粒细胞对囊胚的发育有显著影响（P〈0．05）;卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对囊胚的发育无显著影响（P〉0．05）。不同因素对卵裂率、囊胚率的影响表现为：颗粒细胞因素〉培养液因素〉培养液×颗粒细胞交互作用。结论：TCM199培养液中添加卵泡液和单层颗粒细胞组成的培养系统用于牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的效果较好。共培养体系中的单层颗粒细胞用经酶消化分散处理后在培养箱中孵育10min的颗粒细胞替代时,胚胎的发育效果并不受影响。     

利用TMT标记结合2DLC-MS/MS技术对水牛卵母细胞体外成熟前后差异蛋白质组的分析

本试验利用TMT标记并结合二维高效液相色谱/串联质谱联用的研究策略对水牛卵母细胞成熟前后差异蛋白质组进行分析。试验首先收集水牛成熟前卵母细胞和成熟后卵母细胞,分别提取卵母细胞这两个时期的蛋白质,酶解蛋白后进行TMT标记,其中TMT-126标记成熟后的肽段,TMT-129标记成熟前的肽段,标记后采用强阳离子交换柱对酶解得到的肽段进行分离,接着进行nano LC分离,质谱分析采用在线连接电喷雾串联Orbitrap的方法,最后使用SEQUEST软件进行数据库搜索,采用生物信息学方法对鉴定得到的差异蛋白质进行初步分析。根据定量差异倍数≥2即认为蛋白表达存在差异,鉴定出卵母细胞成熟前高表达的蛋白有18种,成熟后高表达的蛋白有26种。对这些差异蛋白进行生物信息学分析表明,利用TMT标记并结合二维高效液相色谱/串联质谱联用的研究策略可以有效地分离和鉴定水牛卵母细胞成熟前后的蛋白质。本试验发现可能与水牛卵母细胞成熟相关的标志性蛋白:调控细胞凋亡蛋白(BCL2L10)、胎球蛋白(AHSG)、伴侣蛋白(Erp29),这可能为今后研究水牛卵母细胞成熟前后的蛋白质表达变化规律提供了试验依据。     

两种小鼠卵母细胞的核成熟检验方法比较

将生发泡(GV)期小鼠卵母细胞置于M2培养液中培养,分别在培养0 h、4 h、8 h和12 h收集卵母细胞,采用SYTO染色和免疫荧光标记方法进行小鼠卵母细胞的核成熟检验,并将结果进行比较.可以发现:SYTO染色和免疫荧光标记方法都可用于小鼠卵母细胞的核成熟检验,二者的结果没有显著性差异,但是,SYTO染色法更为快速、简便、廉价,可用于活体染色,适合于大规模检测,可应用于哺乳动物卵母细胞的核成熟检验.     

哺乳动物卵母细胞及早期胚胎蛋白质组学研究进展

雌性生殖细胞发育是动物繁殖的基石,哺乳动物卵母细胞和早期胚胎在其生长发育过程中有许多独特的现象和规律,涉及一系列蛋白质合成/降解和磷酸化等状态的动态改变。对卵母细胞分裂、成熟调控机理以及植入前胚胎发育规律的研究是发育生物学领域的一项重要课题。蛋白质组学是以细胞或组织内全部的蛋白质为研究对象,系统鉴定、定量蛋白质并研究这些蛋白质功能的科学。随着蛋白质分离、鉴定技术的快速发展,蛋白质组学为卵母细胞发生、分化、成熟以及质量控制等相关研究提供了新的方法和内容,如在蛋白质定量、修饰、定位和相互作用等方面提供其他组学技术不可获得的重要信息。这些信息将有助于揭示哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育的分子机制,对于进一步完善卵母细胞的体外成熟培养体系,提高胚胎体外生产、体细胞克隆和转基因动物生产效率具有重要意义。     

绵羊卵泡液和次黄嘌呤对卵母细胞体外减数分裂的影响

目的　利用在培养液中添加绵羊卵泡液和次黄嘌呤 ,抑制卵母细胞GVBD发生 ,延长转录活性 ,从而使卵母细胞真正成熟 ,提高胚胎质量及生产效率。方法　利用体外成熟技术对有屠宰采集的绵羊卵母细胞进行培养 ,培养液中添加卵泡液及次黄嘌呤 ,检查成熟效果。结果　将卵母细胞培养在 5 0 %和 10 0 %的卵泡液中 ,2 4h后处于GV期的卵母细胞分别为 19% (8 4 2 )和 33 3% (13 39)。在含有 4mmol L次黄嘌呤的培养液中 ,2 4h后有2 1 6 % (16 74 )的卵母细胞处GV期 ,而对照组中只有 6 % (3 5 0 ) ,经过次黄嘌呤处理的卵母细胞多数都停滞于PⅠ期(44 6 % ,33 74 )。在 4mmol L次黄嘌呤培养液中添加FSH并未使受到抑制的卵母细胞诱导成熟。结论　卵泡液和次黄嘌呤只能在有限的程度上抑制减数分裂的重新启动 ,并对减数分裂的全过程都有影响 ,这种影响程度与抑制因子的浓度相关 ,存在明显的剂量效应。     

卵泡内环境对猪卵泡卵体外成熟和发育的影响

研究卵泡内环境对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育的影响。主要结果如下：直径≥5mm、4－4.9mm、3－3.9mm和2－2.9mm的卵泡卵母细胞体外成熟率分别为90.5%、89.7%、85.4%和67.4%,体外受精后,卵母细胞的发育能力随卵泡直径的增大而增强,直径≥5mm和4－4.9mm卵泡卵的2－细胞、3－4－细胞发育率显著高于直径2－2.9mm的卵泡卵（P＜0.05或0.01）。体外成熟培养36h、42h和48h,直径2－2.9mm卵泡卵的体外成熟率,体外受精后的卵裂率差异不显著（P＞0.05）。在体外成熟培养液中添加5％或15％的不同直径卵泡的卵泡液,各组间卵母细胞的体外成熟率,受精卵的体外发育率均无显著差异,结果表明：卵泡大小对猪卵母细胞体外成熟、受精及受精卵体外发育有重要影响。