酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达

利用PCR技术从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae W303-1A）总DNA中扩增得到1．9kb乙醛脱氢酶编码基因aldh,将其连接到表达载体pEtac,得到重组载体pEtac—aldh,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。对含有aldh的基因工程菌进行表达研究表明：该菌株在37℃下,以1．0mmol／LIPTG诱导5h酶活力达到22．8U,比酶活力为15．0U／mg蛋白,而对照菌株检测不到酶活力,并且该菌的耐乙醛浓度可达3．2g／L。     

丁酸梭菌1，3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT的克隆及在大肠杆菌中的表达

以丁酸梭菌（Clostridium butyricum）基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT,将它连接到pMD18一T载体上,得到重组质粒pMD—dhaT,对此重组质粒进行序列测定,对其DNA序列分析表明,dhaT基因全长为1 158bp。将dhaT基因插入表达载体pSE-380中,构建成重组子pSE—dhaT,并在大肠杆菌JMl09中进行诱导表达。研究表明,以1,3-丙二醇为底物时,基因工程菌在37℃下,以1．0mmol／L IPTG诱导14h,酶活力达到16．28U／mL,比原始菌株提高5、6倍。     

大肠杆菌F18菌毛操纵子全基因克隆、表达及生物学活性

利用PCR技术以猪产肠毒素大肠杆菌F18标准菌株107/86和2134P基因组DNA为模板成功地扩增出编码F18ab和F18ac完整菌毛操纵子fed基因。将它们分别克隆入表达质粒载体pET-22b( ),结合酶切和核苷酸序列分析证明了PCR预期扩增产物的正确性。然后将克隆的重组载体DNA转化至大肠杆菌BL21(DE3),构建和筛选出分别含F18ab和F18ac完整fed基因的重组菌,经过IPTG诱导表达,在电镜下观察到上述两种重组菌能分别大量表达F18ab和F18ac菌毛。用热抽提法提纯其诱导表达的F18ab和F18ac菌毛,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色发现提纯后菌毛获单一分子量约为15kDa蛋白条带,免疫家兔后制备出高效价的兔抗血清,玻板凝集试验和Western blot结果表明:体外诱导表达的F18ab和F18ac菌毛具有和野生F18菌毛相同的抗原性。用表达F18ab和F18ac菌毛的上述2株重组菌分别进行小肠上皮细胞体外吸附试验和吸附抑制试验,结果表明:2株重组菌和野生菌株一样具有较强的粘附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而用表达F18ab和F18ac重组菌提纯的菌毛制备出兔抗血清都能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对易感仔猪小肠上皮细胞的吸附结合。     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉（Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母（Pichia pastoris）中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因（PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合人酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDS－PAGE结果与表达产物酶这性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPAN－Ⅲ菌株达到了在摇庆培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

城市污水处理系统的菌群分析和除氮基因工程出发菌的选择

目的:对脱氮污水处理工艺的活性污泥的菌群组成进行分析,以期获得适合于脱氮基因工程改良的出发菌.方法:首先采用平板稀释法对活性污泥进行菌落计数,并对分离到的菌落进行详细的生化鉴定,对其中的优势菌-假单胞菌进行脱氮能力测定,并分析其对常作为筛选标志的抗生素的药物敏感性.结果:发现在采用该工艺的活性污泥中,优势菌为假单胞菌、肠杆菌、莫拉菌和不动杆菌,分别占总菌数的23%、16%、16%和12%.根据菌群分析的结果,从中选择了两株耐药性弱、脱氮能力强的菌作为基因改良的出发菌.结论:本研究阐明了活性污泥的菌群构成,获得了两株适合基因工程改良的菌株,为日后脱氮基因工程菌的构建奠定基础.     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

肉毒碱乙酰转移酶基因敲除对长链二元酸生产代谢过程的影响

在利用热带假丝酵母发酵生产长链二元酸的过程中 ,脂肪酸将进入 β 氧化途径 ,代谢产生能量 ,从而降低产物收率。首次以负责运输的肉毒碱乙酰转移酶为改造目标 ,在肉毒碱乙酰转移酶基因中插入潮霉素B抗性基因 ,构建DNA转化质粒 ,并进行一次同源重组 ,得到肉毒碱乙酰转移酶基因单拷贝敲除的基因工程菌。根据摇瓶实验结果 ,该基因工程菌与原始菌株相比 ,十三碳二元酸的产量与摩尔转化率分别提高了 13 0 %和 11 8%。     

利用S-层蛋白在细胞表面展示α-淀粉酶和金属硫蛋白

选用苏云金芽胞杆菌CTC菌株细胞表面S 层蛋白作为表面展示载体 ,利用其N 端信号肽以及锚定序列分别将不同生物特性的外源蛋白带到胞外并锚定在细胞的表面。为研究外源蛋白的分子量和生化特性对表面展示以及对其在细胞表面生物活性的影响 ,选用分子量较大的分泌性蛋白α 淀粉酶和富含半胱氨酸的非分泌性蛋白金属硫蛋白作为目标蛋白。将α 淀粉酶的结构基因 (amy)和金属硫蛋白的结构基因 (smtA)与S 层蛋白的锚定区slh结合 ,构建融合蛋白基因slh amy及slh smtA ,克隆至穿梭载体pHT30 4上 ,得到重组质粒pBMBSA 30 4和pBMBSM 30 4 ;转入带有帮助质粒的重组菌株BMB171 pBMB CSA中 ,得到新的重组菌株BMBSAC和BMBSMC。SDS PAGE显示融合蛋白SLH AMY和SLH SMTA在重组菌的表面得到了表达。利用锥虫蓝染色 打孔加膜法表明重组菌SAC的确具有表面酶活性 ,α 淀粉酶被固定在细胞表面。碘液法测定的数据表明重组菌SAC的菌悬液样品较之受体菌BMB171菌悬液样品酶活提高了 4 2 4 %。Ni NTA 琼脂糖微球吸附试验显示重组菌SMC能够被微球所吸附 ,证实SMTA在重组菌表面具有活性。对游离镉离子的吸附试验显示重组菌对镉离子的吸附能力是对照受体菌的 4倍。     

菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达及乙醇发酵

以乙醇耐受力较强的酿酒酵母为受体菌,构建了能够分泌菊粉酶的基因工程菌并进行了菊芋粉的生料发酵。首先,以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus中的基因组DNA为模板,PCR扩增菊粉酶编码基因inu,分别使用菊粉酶自身启动子和酵母磷酸甘油激酶 (Phosphoglycerate kinase,pgk) 启动子,构建重组表达质粒HO/p-inu和HO/pgk-inu。经NotⅠ线性化后,采用电击法转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6525,分别得到含菊     

Red同源重组技术研究进展

伴随着分子生物学的发展,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40～60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。     

γ-谷氨酰基转肽酶（GGT）基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究

利用PCR技术以Bacillus subtilis SYU 20016基因组DNA为模板,扩增出1.8kb编码γ-谷氨酰基转肽酶的基因ggt,将其连接到温控表达载体pBV220,得到重组载体pBV220-ggt,重组载体在大肠杆菌JM109中得到表达。SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量大小为65kD,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有ggt的基因工程菌进行表达研究表明：发酵的培养温度为30℃,pH为7.2,装液量为20mL(在250mL的锥形瓶中)的条件下42℃诱导4h后,重组菌的γ-谷氨酰基转肽酶酶活力达到6U/mL,目前报道的非基因工程菌（枯草芽孢杆菌NX-2）酶活力最高仅为3.2U/mL。     

一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统

随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。嗜盐古菌Haloferax volcanii易于培养,是研究古菌基因功能的良好模式菌株。虽然现已开发了多种嗜盐古菌的遗传操作系统,但基因敲除成功率不十分理想。这些遗传操作方法基于pyrE筛选标记,利用携带同源片段的环状质粒与基因组同源片段间的两次同源重组,敲除目的基因。由于基于环状质粒和pyrE筛选标记的经典同源重组敲除方法在二次重组时,普遍存在回复到野生型菌株的可能,导致二次重组子中敲除目的基因的阳性菌株比例较低。为了克服传统同源重组技术的上述缺陷,文章建立了基于线性DNA片段的同源重组技术。该方法通过一次重组在目标基因的下游引入一段上游同源片段和pyrE标记,从而限定二次重组的发生部位只能在两段上游同源片段之间,发生二次重组的重组子理论上都敲除了目标基因。利用该方法,文章成功敲除了嗜盐古菌Haloferax volcanii的xpd2基因,阳性克隆率达65%。这种线性DNA片段重组法为嗜盐古菌的基因敲除提供了一种高效策略,便于嗜盐古菌的基因改造。     

应用QC-PCR技术研究高效菌株Rhodococcus ruber Em1在废水处理中的作用

应用竞争性定量PCR(QC-PCR)技术,对石化废水处理系统中投加的高效芳烃降解菌株Rhodococcus ruber Em1数量变化趋势及其作用进行了分析。持续5个月从处理系统中不定期采集活性污泥样品,进行Em1菌株定量测定和处理系统的效果分析。结果表明,基于16S rRNA基因的特异引物具菌种水平的特异性,用其扩增污泥总DNA,并对产物克隆测序,所扩增的产物中62.2%为Em1菌株16S rRNA基因片段。检测得到活性污泥样品中含Em1菌株数量范围为3.4×105～4.3×108CFU/g,表明所投加的高效降解菌在处理系统中长期稳定存活并繁殖;Em1菌量与COD去除量之间的相关性系数(R2)高达0.89,表明Em1菌量与系统的处理效果具有明显的正相关性。这些结果说明,投加的Em1菌株在高浓度多环芳烃等污染物存在的条件和复杂菌群环境中,仍能长期稳定地存活并繁殖,在废水处理系统中发挥重要的作用。     

富含蛋氨酸玉米醇溶蛋白在枯草芽胞杆菌中的表达

蛋氨酸是畜禽饲料中的第一限制性氨基酸,也是饲料产品进行质量控制与质量评价最为关注的指标之一。利用基因工程方法,从玉米胚乳中克隆高蛋氨酸蛋白基因（10kuδzein）,与pHT43构建重组表达质粒,将其转入枯草芽胞杆菌中,IPTG诱导其表达,发现重组菌在26ku处出现了1条明显条带。HPLC检测蛋氨酸含量,重组菌的蛋氨酸含量比野生型菌株提高了20．51％。该重组菌为以后将其做为饲料添加剂进一步应用提供了技术基础。     

非随机方法构建酿酒酵母基因工程菌

酿酒酵母是基因工程产品研究和生产的一个重要表达系统,表达载体和宿主细胞是构成表达系统的两大要素,虽然外源基因表达的方式、强度主要由表达载体控制．但宿主细胞的选择对最终获取产品的质量和数量也具有十分关键的作用。酿酒酵母基因工程宿主菌除要求具有高的DNA转化效率、细胞生长密度和稳定性、低的内源蛋白水解酶活性外,还必须具备与表达载体相对应的营养缺陷筛选标记,用传统随机诱变方法得到的营养缺陷变异株,因含有本底和隐性突变,在细胞生长密度和稳定性方面往往不能满足基因工程产品研究和生产的要求,甚至不能有效地表达外源基因。本文报道用重组技术,通过非随机方法构建了酿酒酵母基因工程宿主茁。研究表明用该方法得到的宿主菌在细胞生长密度、稳定性和表达外源基因方面优于用传统随机诱变方法得到的宿主菌。     

一株耐Cd菌株的分离、鉴定及基本特性

【目的】从活性污泥中筛选耐镉(Cd)菌株,并研究其生长特性及对溶液中Cd~(2+)吸附的最佳条件,以期为重金属Cd污染水体的微生物修复提供菌株资源和应用技术参考。【方法】采用平板划线法,从活性污泥中分离、筛选、驯化出耐Cd菌株,通过16SrRNA基因序列分析及溶血试验、蛋白质毒素结晶试验进行初步鉴定,并采用单因素实验优化菌株的培养条件,通过正交实验确定菌粉吸附溶液中Cd~(2+)的最佳条件,同时利用SEM-EDS及FTIR分析探讨菌粉吸附Cd~(2+)的机理。【结果】经分离、驯化得到1株耐Cd细菌菌株,命名为H6,初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus),最大Cd~(2+)耐受浓度为350 mg/L。菌株H6的最佳生长条件为:pH 6.0–8.0,温度28°C,转速120–210 r/min,接种量1%–5%;菌株H6在生长过程中,培养液pH值先稍微下降然后不断上升。菌粉吸附Cd~(2+)的正交优化条件为:菌粉用量0.125 g/L,吸附时间2 h,pH 5.0,温度30°C,此条件下吸附量为205 mg/g。SEM-EDS分析和红外光谱(FTIR)分析表明,在吸附过程中主要作用基团有羟基、羧基、羰基、酰胺基和烷基,此外,Ca~(2+)与Cd~(2+)发生了离子交换。【结论】从活性污泥中分离出的菌株H6,初步鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),是1株具有较强Cd~(2+)吸附能力的细菌菌株。     

产L-乳酸的运动发酵单胞菌代谢工程菌株的构建

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)CP4基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆得到其丙酮酸脱氢酶基因(pdc)同源下游p3片段,并连接到广谱宿主载体pBBR1MCS3-Ppdc-ldhL中构建了重组质粒pBBR1MCS3-Ppdc-ldhL-p3,将此重组质粒转化到受体菌Z.mobilis CP4中,分别以Ppdc和p3片段作为同源上游和下游片段,利用同源双交换重组技术将重组质粒中的ldhL基因置换了Z.mobilis染色体中的pdc基因,得到重组菌株Z.mobilis CP4(△pdc∷ldhL).测得重组菌株乳酸产量为10.8g/L,明显高于出发菌株,说明初步成功构建了产L-乳酸的运动发酵单胞菌代谢工程菌株.     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建

通过基因重组等技术构建重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌,并对此基因工程菌进行生长曲线的测定和稳定性分析。结果表明,海参溶菌酶基因特异引物在400 bp处扩增出特异性条带,与预期的海参溶菌酶基因大小一致;重组表达质粒pHT43-SjLys经双酶切验证得8 000 bp和400 bp左右的片段;重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌与原始菌株WB600相比生长趋势基本一致,外源基因的插入对菌体的生理代谢未造成太大影响;在无选择压力的条件下,重组质粒的稳定性良好,连续传5次后的遗传稳定性为94%,并且提取质粒和双酶切验证后发现工程菌没有发现重排或丢失现象。表明重组海参溶菌酶基因工程菌pHT43-SjLys/WB600构建成功。     

ADH7启动子精细调控表达MSN2酿酒酵母菌株对 糠醛耐受的研究

【目的】构建自我精细调控表达应激转录调控基因MSN2的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌株,提高其对糠醛的耐受能力。【方法】以酿酒酵母BY4742基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得ADH7启动子、CYC1终止子以及MSN2编码框序列,以pUG6质粒为载体构建含ADH7p-MSN2-CYC1t表达盒的重组表达质粒pUG6-AM。通过醋酸锂法,将线性化后的质粒pUG6-AM转入酿酒酵母BY4742,筛选阳性转化子,初步分析其对糠醛的耐受能力,采用荧光定量PCR技术检测MSN2基因及其调控代表基因的转录变化。【结果】构建了在ADH7启动子控制下表达MSN2的酿酒酵母基因工程菌株AM01,该菌株对糠醛耐受能力明显增强,MSN2基因的转录得到了自我精细调控,并提高了其调控基因的转录水平。【结论】以糠醛诱导表达基因的启动子精细调控应激转录调控基因MSN2的转录表达,既可提高酿酒酵母工程菌株对糠醛的耐受能力,又能避免其持续高效表达带来的副作用。