木酮糖激酶基因整合表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

【目的】以载体p406ADH1为构建骨架,构建一个酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株的整合表达载体。【方法】通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为筛选标记的G418抗性基因KanR,用于基因表达的ADH1终止子片段,酿酒酵母W5自身木酮糖激酶基因,18S rDNA介导的同源整合区,插入到骨架质粒p406ADH1中,得到多拷贝整合表达载体pCXS-RKTr。将该载体线性转化酿酒酵母后,对转化子中木酮糖激酶酶活进行测定,检测其表达情况。【结果】重组质粒在酿酒酵母体内实现了木酮糖激酶的高水平稳定表达,其酶活力是初始菌株的2.87倍。【结论】本实验构建了一个酿酒酵母工业菌株整合表达载体,并用此载体过表达了其自身的木酮糖激酶基因。该重组质粒载体的构建可以有效解决酿酒酵母中自身木酮糖激酶酶活较低的情况,这为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建和其它酵母重组质粒载体的构建奠定基础。     

转醛醇酶基因差异表达影响酵母发酵木糖及耐受乙酸性能

【目的】木糖发酵是纤维素燃料乙醇生产的一个关键瓶颈,同时木质纤维素水解液中的乙酸严重抑制酿酒酵母的木糖发酵过程,因此通过基因工程手段提高菌株对木糖的利用以及对乙酸的耐受性具有重要意义。本研究以非氧化磷酸戊糖途径(PPP途径)中关键基因转醛醇酶基因(TAL1)为研究对象,探讨了3种不同启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4,控制其表达对菌株利用木糖和耐受乙酸的影响。【方法】通过同源重组用3种启动子替换酿酒酵母基因工程菌NAPX37的TAL1基因的启动子PTAL1,再通过孢子分离和单倍体交配构建了纯合子,利用批次发酵比较了在以木糖为唯一碳源和混合糖(葡萄糖和木糖)为碳源条件下,3种启动子控制TAL1基因表达导致的发酵和乙酸耐受能力的差异。【结果】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4在不同程度上提高了TAL1基因的转录水平,提高了菌株对木糖的利用速率及乙酸耐受能力,提高了菌株在60 mmol/L乙酸条件下的葡萄糖利用速率。在以木糖为唯一碳源且无乙酸存在、以及混合糖为碳源的条件下,PAHP1启动子控制TAL1表达菌株的发酵结果优于PTDH3和PUBI4启动子的菌株,PAHP1启动子控制的TAL1基因的转录水平比较合适。在木糖为唯一碳源且乙酸为30 mmol/L时,PUBI4启动子控制TAL1基因表达的菌株发酵结果则优于PAHP1和PTDH3启动子菌株,此时PUBI4启动子控制的TAL1的转录水平比较合适。【结论】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4不同程度地提高TAL1基因的表达,在不同程度上改善了酵母菌株的木糖发酵速率和耐受乙酸性能,改善程度受发酵条件的影响。     

苏云金芽胞杆菌LM1212菌株cry基因启动子的活性分析

【背景】前期发现一株具有独特分化表型的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)LM1212,该菌株共有14种杀虫基因,组成了10个转录单元。利用源自菌株LM1212的晶体产生细胞调控因子(crystal producing cell regulator, CpcR)以及其可以激活的cry35-like基因启动子,已在典型Bt菌株HD73中成功构建了非芽胞杀虫蛋白表达体系。【目的】比较菌株LM1212的不同杀虫基因启动子的转录活性,明确可被转录因子CpcR激活的且转录活性较高的启动子,以此为基础优化非芽胞杀虫蛋白表达体系。【方法】将10个启动子区域分别与lacZ报告基因融合构建在pHT304-18Z载体上,得到了10个重组质粒;然后将cpcR基因及其启动子(PcpcR-cpcR)分别反向构建在选取的启动子区域与lacZ报告基因的上游,得到可以表达CpcR且与上述构建相对应的10个重组质粒,将这些重组质粒分别转入不含CpcR的菌株HD73,即获得20个可用于测定β-半乳糖苷酶活性的重组菌株。通过光学显微镜观察和SDS-PAGE检测明确杀虫蛋白表达的情况。【结果】在...     

甾醇C-24甲基转移酶和甾醇C-8异构酶在酿酒酵母麦角甾醇生物合成中的调控作用

摘要：【目的】研究ERG6基因编码的甾醇C-24甲基转移酶和ERG2基因编码的甾醇C-8异构酶在酿酒酵母麦角甾醇生物合成代谢中的调控作用。【方法】通过PCR扩增克隆到酿酒酵母甾醇C-8异构酶的编码序列及其终止子序列,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,以磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒pPERG2;同时,在本实验室已构建的ERG6表达质粒pPERG6的基础上,构建了ERG2和ERG6共表达的重组质粒pPERG6-2。将表达质粒转化酿酒酵母单倍体菌株YS58,依据营养缺陷互补筛选到重组菌株YS58(pPERG2)和YS58(pPERG6-2)。通过紫外分光光度法和气相色谱法分析重组菌株甾醇组分和含量。【结果】在ERG6高表达的重组酵母菌中,甾醇中间体和终产物麦角甾醇的含量均比对照菌高;而在ERG2高表达的酵母菌株中,无论甾醇中间体,还是麦角甾醇的含量均明显降低。ERG6和ERG2共表达重组菌株YS58(pPERG6-2)的麦角甾醇含量是对照菌株YS58(YEp352)的1.41倍,是ERG2单独高表达菌株YS58(pPERG2)的1.92倍,是ERG6单独高表达菌株YS58(pPERG6)的1.12倍。【结论】本研究首次证明甾醇C-24甲基转移酶催化的反应是酿酒酵母麦角甾醇合成代谢途径中的一个重要的限速步骤,该酶活性提高不但补偿了ERG2高表达对甾醇合成的负效应,而且使麦角甾醇含量进一步提高,为构建麦角甾醇高产酵母工程菌株提供了实验依据。     

过表达tRNA基因tL(CAA)K提高酿酒酵母乙酸耐受性

乙酸是木质纤维素类生物质水解液中的常见毒性抑制物,选育乙酸耐受性好的酿酒酵母菌株,有利于高效利用木质纤维素类生物质,发酵生产生物燃料和生物基化学品。目前对酿酒酵母抗逆性的研究多集中在转录水平,但对转运RNA (Transfer RNA,tRNA) 在耐受性中的作用研究较少。在对酿酒酵母抗逆性研究过程中发现,一些转运RNA基因在耐受性好的酿酒酵母菌株中转录明显上调。本文深入分析了精氨酸tRNA基因tR(ACG)D和亮氨酸tRNA基因tL(CAA)K过表达对酿酒酵母耐受木质纤维素水解液的影响。结果表明,在4.2 g/L乙酸胁迫条件下进行乙醇发酵时,过表达tL(CAA)K的菌株生长和发酵性能均优于对照酵母菌株,乙醇生产强度比对照菌株提高了29.41%,但过表达tR(ACG)D基因的菌株生长和代谢能力较对照菌株明显降低,体现了不同tRNA的不同调控作用。进一步分析发现,过表达tL(CAA)K的重组酵母菌株乙酸耐受性调控相关基因HAA1、MSN2和MSN4等胁迫耐受性相关转录因子编码基因的转录水平上调。本文的研究为选育高效利用木质纤维素资源进行生物炼制的酵母菌株提供了新的改造策略,也为进一步揭示酿酒酵母tRNA基因表达调控对抗逆性的影响提供了基础。     

酿酒酵母ADH3基因的敲除

设计含有与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编码乙醇脱氢酶Ⅲ的ADH3基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除组件。转化酿酒酵母YS3(Saccharomyces cerevisiae),并将质粒pSH65转入阳性克隆子。半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr基因,在YPD培养基中连续传代培养丢失pSH65质粒,在原ORF处留下一个loxP位点,获得ADH3单倍体缺陷型菌株。利用同样的方法再次敲除双倍体的另一个等位基因。最终获得ADH3双倍体基因缺陷型突变株YS3-ADH3。     

甾醇酰基转移酶基因高表达对酵母菌麦角甾醇合成的影响

通过PCR扩增克隆到含酵母菌甾醇酰基转移酶基因ARE2编码序列和上游调控序列的DNA片段ARE21及仅含编码序列的DNA片段ARE22。分别以ARE2启动子,乙醇脱氢酶基因ADH1启动子和铜抗性基因CUP1启动子及ADH1终止子为调控元件构建了酵母菌表达质粒pHX2,pHXA2和pHXC2。表达质粒分别转化酿酒酵母单倍体菌株YS58和以前通过细胞杂交构建的麦角甾醇高产菌株YEH56。通过营养缺陷互补和铜抗性筛选到转化子,质粒上的ARE2基因在YS58和YEH56中都实现了活性表达,使细胞内甾醇酯化水平升高,并导致细胞麦角甾醇含量的提高。对转化菌株的培养条件进行了初步研究,在优化条件下,重组转化菌株YEH56(pHX2)、YEH56(pHXA2)和YEH56(pHXC2)的麦角甾醇含量分别是受体菌YEH56 的13、13和14倍。     

氧化胁迫对酿酒酵母NAD(H)激酶突变体呼吸链活性的影响

【目的】了解酿酒酵母线粒体NAD(H)激酶Pos5p对呼吸链活性的维持是否与其抗氧化功能有关。【方法】比较在不同类型的氧化胁迫试剂作用下,野生菌BY4742、POS5基因缺失体pos5Δ及其回补体pos5Δ/POS5-YEp的呼吸链各个酶复合体的活性变化及细胞内活性氧水平变化。【结果】在非胁迫条件下,pos5Δ的各个复合体活性明显低于BY4742,而pos5Δ/POS5-YEp的活性有所恢复,这与它们的胞内活性氧水平相一致。在甲萘醌胁迫下,BY4742和pos5Δ的各个复合体活性都发生不同程度的下降,但pos5Δ/POS5-YEp的活性都升高。在H2O2、马来酸二乙酯胁迫下,除个别复合体外,BY4742、pos5Δ和pos5Δ/POS5-YEp的呼吸链复合体活性都降低,尤以pos5Δ的活性降低最为严重,BY4742的活性降低则较少,而pos5Δ/POS5-YEp在H2O2胁迫下的活性降低得到了缓解。说明甲萘醌、H2O2和马来酸二乙酯胁迫会造成酿酒酵母呼吸链各个复合体发生损伤,而过表达Pos5p则有助于缓解甲萘醌和H2O2引起的损伤。【结论】Pos5p对呼吸链的作用与其抗氧化功能有相关性。     

利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子

[目的]克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性.[方法]采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp.将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp.通过电击转化酿酒酵母W303-lA.将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测.[结果]重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强.[结论]PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义.     

过表达长链鞘氨醇激酶基因LCB4提高酿酒酵母抑制物耐受性

木质纤维素预处理过程中产生的有毒副产物严重影响了纤维素乙醇发酵,提高酿酒酵母抑制物耐受性是提高纤维素乙醇发酵效率的有效方法。文中通过过表达LCB4基因,研究了重组菌株S288C-LCB4在乙酸、糠醛和香草醛胁迫下的细胞生长和乙醇发酵性能。结果表明,LCB4过表达菌株在分别含有10 g/L乙酸、1.5 g/L糠醛和1 g/L香草醛的平板中生长均优于对照菌株;在分别含有10 g/L乙酸、3 g/L糠醛和2 g/L香草醛的液体乙醇发酵过程中,重组菌株S288C-LCB4乙醇发酵产率分别为0.85 g/(L·h)、0.76 g/(L·h)和1.12 g/(L·h),比对照菌株提高了34.9%、85.4%和330.8%;且糠醛和香草醛胁迫下发酵时间分别缩短了30 h和44 h。根据发酵终点发酵液代谢物分析发现重组菌株比对照菌株产生了更多甘油、海藻糖和琥珀酸,这些物质有利于增强菌株的抑制物耐受性。综上所述,LCB4基因过表达可显著提高酿酒酵母S288C在乙酸、糠醛和香草醛胁迫下的乙醇发酵性能。     

Construction of a flocculent Saccharomyces cerevisiae strain secreting high levels of Aspergillus niger β-galactosidase

A flocculent Saccharomyces cerevisiae strain secreting Aspergillus niger beta-galactosidase activity was constructed by transforming S. cerevisiae NCYC869-A3 strain with plasmid pVK1.1 harboring the A. niger beta-galactosidase gene, lacA, under the control of the ADH1 promoter and terminator. Compared to other recombinant S. cerevisiae strains, this recombinant yeast has higher levels of extracellular beta-galactosidase activity. In shake-flask cultures, the beta-galactosidase activity detected in the supernatant was 20 times higher than that obtained with previously constructed strains (Domingues et al. 2000a). In bioreactor culture, with cheese-whey permeate as substrate, a yield of 878.0 nkat/gsubstrate was obtained. The recombinant strain is an attractive alternative to other fungal beta-galactosidase production systems as the enzyme is produced in a rather pure form. Moreover, the use of flocculating yeast cells allows for enzyme production with high productivity in continuous fermentation systems with facilitated downstream processing.     

液泡蛋白酶B对酿酒酵母高温乙醇发酵效率的影响

【目的】提高酿酒酵母的高耐温性,从而提高菌株在高温下的乙醇发酵性能。【方法】利用染色体整合过表达酿酒酵母液泡蛋白酶B编码基因PRB1。【结果】在41 °C高温条件下进行乙醇发酵,过表达PRB1基因的重组酿酒酵母菌株可在31 h内消耗全部的葡萄糖,而对照菌株在相同时间内仅消耗不到一半的葡萄糖。【结论】利用蛋白酶B基因过表达可构建耐高温酿酒酵母菌株,提高在高温条件下乙醇的发酵效率。     

Trehalose promotes the survival of Saccharomyces cerevisiae during lethal ethanol stress, but does not influence growth under sublethal ethanol stress

Trehalose is known to protect cells from various environmental assaults; however, its role in the ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae remains controversial. Many previous studies report correlations between trehalose levels and ethanol tolerance across a variety of strains, yet variations in genetic background make it difficult to separate the impact of trehalose from other stress response factors. In the current study, investigations were conducted on the ethanol tolerance of S. cerevisiae BY4742 and BY4742 deletion strains, tsl1 Δ and nth1 Δ, across a range of ethanol concentrations. It was found that trehalose does play a role in ethanol tolerance at lethal ethanol concentrations, but not at sublethal ethanol concentrations; differences of 20–40% in the intracellular trehalose concentration did not provide any growth advantage for cells incubated in the presence of sublethal ethanol concentrations. It was speculated that the ethanol concentration-dependent nature of the trehalose effect supports a mechanism for trehalose in protecting cellular proteins from the damaging effects of ethanol.     

产β-胡萝卜素酿酒酵母工程菌的构建

以酿酒酵母SaccharomycescereviaiaeBY4742为宿主菌,利用DNA组装（DNAassemble）技术,向宿主菌导入了β-胡萝卜素合成途径,表达了源自Xanthophyllomycesdendrorhous的CrtE,Cn馏和CrtI3个基因,获得了一株染色体整合型工程菌株HCCB08531,β-胡萝卜素产量达3．68mg／g干重。     

酒类酒球菌mleP基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

苹果酸通透酶具有协助苹果酸 乳酸发酵 (MLF)的重要功能。以酒类酒球菌 (Oenococcusoeni)优良菌系Oenococcus Lee SD 2a的总DNA为模板 ,用PCR方法克隆到苹果酸通透酶基因mleP ,构建了重组质粒pBMmleP。序列分析表明克隆到的基因序列与已报道的序列同源性为 99%。为使目的基因在酿酒酵母中表达 ,以大肠杆菌 酿酒酵母穿梭质粒YEp35 2为载体 ,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件 ,构建了重组表达质粒YEpmleP ,并转化酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)YS5 8。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。获得的转化子在添加了L 苹果酸 (5g L)的培养基中培养 4d ;取培养液上清用HPLC检测 ,结果显示重组转化子YSP的培养液中L 苹果酸剩余含量均低于空载体转化子YS35 2 ,因此所得酵母重组转化子对苹果酸的转运能力有所提高