栽培条件对灵芝子实体的三萜组成及其活性的影响

以不同灵芝品种、不同栽培基质、不同管理方式、不同生长时期获得的灵芝子实体为原料,用95%乙醇超声提取,对提取物进行了含量测定、三萜组成分析和体外抗肿瘤实验。结果表明,不同子实体醇提物中三萜和甾醇类物质的含量在4.60-6.20mg/g之间;高效液相分析发现10种三萜化合物的种类和含量在样品间存在明显差异。所有灵芝子实体醇提物对肿瘤细胞L1210的增殖均有一定的抑制作用,开伞期的灵芝子实体醇提物抑制肿瘤增殖的活性优于其他生长时期。     

长根静灰球活性物质提取及体外抗肿瘤作用研究

以长根静灰球为原料,石油醚为溶媒,进行索氏提取,抽滤、干燥后得到石油醚提取物;滤渣干燥后,同样的方法依次加入乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、蒸馏水进行提取,分别得到乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、乙醇提取物和水提取物。采用MTT法检测不同溶剂提取物对MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、Hela(子宫颈癌细胞)细胞的细胞活力的抑制作用,对正丁醇提取物处理过的MDA-MB-231细胞进行胞内活性氧(ROS)测定、线粒体膜电位检测和DAPI检测细胞凋亡,用倒置荧光显微镜观察。结果发现长根静灰球提取物可以诱导MDA-MB-231、Hela细胞活力降低,特别是正丁醇提取物,对MDA-MB-231和Hela细胞的细胞活力有明显的抑制作用,正丁醇提取物的浓度在200μg/m L时,细胞活力被显著抑制。相比Hela,MDA-MB-21对于提取物的作用较为敏感。长根静灰球正丁醇提取物,能使MDA-MB-231细胞活力明显下降,线粒体膜电位显著下降,胞内活性氧显著增加,通过产生ROS调节线粒体途径引发细胞凋亡。     

HPLC法测定灵芝孢子粉中三萜含量

为准确测定灵芝孢子粉中三萜的含量,运用高效液相建立适合孢子粉的分析测定方法。通过对前处理条件的优化,确定40%乙醇为孢子粉中等极性三萜酸类的最佳提取溶剂,浓缩倍数是子实体提取条件的50倍。通过色谱柱和洗脱条件的优化,建立了包括灵芝酸I、灵芝烯酸C、灵芝酸C2等13种标准品测定方法,方法学考察显示该分析方法精密度、重复性、稳定性的RSD值均小于5%,可以用于灵芝孢子粉中三萜类成分的定量检测。通过5组样品的分析发现,灵芝酸C6、灵芝酸G、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝酸F是灵芝孢子粉中的主要三萜类成分,其中灵芝酸A含量最高,平均占样品三萜总量的比例达19.71%;三萜类成分的溶出量与是否破壁没有相关性。三萜类成分在灵芝孢子粉和灵芝孢子油产品中的含量非常低,孢子粉的三萜含量为14.24-99.70μg/g,仅为子实体的1/100,灵芝孢子油中三萜含量也均低于50μg/g,因此三萜类成分不适合作为灵芝孢子粉及其相关产品的定量检测指标。     

灵芝子实体和孢子粉三萜含量的测定及体外抗肿瘤活性的评价

目的测定灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉中的三萜含量,并评价其醇提物的体外抗肿瘤活性。方法采用高氯酸显色法测定灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉中的三萜含量,采用磺酰罗丹明B蛋白染色法(sulforhodamine B,SRB)评价灵芝子实体和破壁灵芝孢子粉醇提物对宫颈癌He La细胞、结肠癌HCT-116细胞和乳腺癌MCF-7-ADM细胞的体外抗肿瘤活性。结果研究的灵芝子实体中三萜质量分数为0.92%,破壁灵芝孢子粉供试品中三萜质量分数实测值为2.95%,但是灵芝孢子粉中脂肪油对高氯酸显色法有极大的干扰,因此破壁灵芝孢子粉三萜的实测值可能远高于实际值。活性评价结果显示,灵芝子实体的醇提物在100μg/m L时,其对人宫颈癌He La细胞和乳腺癌MCF-7-ADM细胞表现出了较强的抑制作用,抑制率分别为94.54%和71.30%;对结肠癌HCT-116细胞表现出较弱的抑制作用,抑制率为20.68%。破壁灵芝孢子粉的醇提物在100μg/m L和10μg/m L时,其对宫颈癌He La细胞表现出了弱的抑制作用,对另外2种细胞系仅在100μg/m L时表现出较弱的抑制作用。结论灵芝子实体的醇提物含有三萜并具有较好的抗肿瘤活性,可以将其开发为辅助治疗癌症的药物或保健品。含有脂肪油的灵芝孢子粉直接采用高氯酸比色法测定会高估其三萜的含量,需要进一步开发准确、可行的测定方法。     

1950 MHz射频电磁场对SRA01/04细胞周期和凋亡的影响

目的：研究显示射频电磁场与白内障的发生关系密切,为了评价晶状体上皮细胞在射频电磁场诱导的白内障发生中的作 用,本实验探讨了1950 MHz射频电磁场暴露对人眼晶状体上皮细胞株（SRA01/04）细胞周期与凋亡的影响。方法：将处于对数生 长期的SRA01/04 细胞暴露或假暴露于频率为1950 MHz,比吸收率（SAR）为2.79 W/kg 的射频电磁场中,每天暴露1 h,每周暴露 5 天,连续暴露4 周。暴露结束后立即收集细胞,显微镜下观察细胞形态变化,噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活力,流式细胞仪 （FCM）检测细胞周期与凋亡。结果：与假辐照组相比,暴露组细胞形态未见明显变化;细胞存活力、细胞周期分布及细胞凋亡率亦 无显著改变（P>0.05）。结论：1950 MHz射频电磁场暴露4 周对SRA01/04 细胞的形态、活力、周期以及凋亡均无明显影响,提示在 本实验条件下1950 MHz 射频电磁场不会诱发白内障的发生。     

乙醇浓度对提取灵芝三萜含量的影响及提取物抗前列腺癌细胞LNCaP的活性

本研究考察乙醇浓度对灵芝子实体中三萜成分提取的影响及提取物抗前列腺癌细胞LNCaP的增殖活性和迁移能力,为提取灵芝三萜时乙醇浓度的选择和灵芝抑制前列腺相关疾病产品开发提供依据。研究采用高效液相（HPLC）色谱法测定了灵芝醇提物中目前具有代表性的9种三萜的含量;并用抑制前列腺癌细胞LNCaP的细胞活性和细胞迁移能力的实验研究灵芝提取物的抗前列腺癌的作用。HPLC测定结果显示,当乙醇浓度为50%-80%时,9种灵芝三萜的含量随着乙醇浓度的升高而增大;当乙醇浓度继续升高至95%时,提取的三萜含量反而有所降低。细胞实验结果显示,4个浓度乙醇的灵芝提取物都具有良好的抑制LNCaP肿瘤细胞增殖作用和阻滞LNCaP细胞迁移能力。因此在使用乙醇提取灵芝三萜时,乙醇浓度升高有利于三萜的提取;在生产灵芝抗前列腺相关产品时,提取灵芝子实体中抗前列腺增生的活性成分时选用80%的乙醇较为适宜。     

基于UPLC-MS/MS定量检测法优化灵芝三萜热回流提取工艺的研究

基于超高效液相-三重四级杆质谱联用（UPLC-MS/MS）定量检测法优化出一种灵芝三萜热回流提取的工艺。通过本实验建立的灵芝三萜UPLC-MS/MS精确方法检测不同来源的7个栽培品种灵芝子实体中19个三萜化合物的含量,筛选出三萜含量较高的sd-2灵芝子实体作为提取原料,以三萜含量和提取物得率为指标,通过单因素和响应面实验对灵芝三萜的热回流工艺进行优化,获得的最佳条件为：乙醇浓度75%、提取时间2.5h、液料比14:1、提取次数2次。对获得的最佳提取工艺进行中试实验,灵芝子实体乙醇提取物的得率为6.10%,三萜含量为11.8591mg/g。研究结果可为灵芝三萜的工业大规模提取提供理论依据,为灵芝高附加值产品的开发利用提供技术支撑。     

高速逆流色谱法分离灵芝中的灵芝烯酸B

本实验建立一种快速从灵芝子实体中制备灵芝烯酸B的方法。以沪农灵芝1号子实体乙醇提取物为原料,经过D101大孔树脂粗分,用60%乙醇洗脱后,采用高速逆流色谱对获得的灵芝酸性三萜进行分离制备。确定最佳溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（V/V/V/V,5:5:2:9）,上相作为固定相,下相作为流动相,单因素法和正交实验设计确定高速逆流色谱法分离灵芝烯酸B的最佳工艺为：流速2.0mL/min,转速900r/min,一次上样量为500mg时,制备得到灵芝烯酸B化合物得率为(9.07±0.16)%,纯度为(85.04±3.45)%。用质谱、核磁对得到的灵芝烯酸B进行了结构鉴定。此法操作简单高效,为大量制备灵芝烯酸B提供了参考。     

柚皮中的有效成分对人子宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨柚皮素或柚皮苷对人子宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响。方法柚皮素或柚皮苷(0.250、0.125、0.063g/L)作用于人子宫颈癌Hela细胞后,MTT比色法检测Hela细胞增殖活性和半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50);流式细胞术检测柚皮素对Hela细胞凋亡的影响。结果柚皮素能抑制Hela细胞增殖,且呈剂量和时间依赖性,24、48和72hIC50值分别为0.24、0.11和0.07g/L;柚皮苷无抑制Hela细胞增殖的作用。柚皮素组(0.22g/L、0.11g/L、0.05g/L,作用48h)人子宫颈癌Hela细胞凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000239681,P=0.00012746,P=5.09328E-05,P0.01)。结论柚皮中黄酮类提取物具有抑制人子宫颈癌Hela细胞增殖作用,其中柚皮素作用明显,部分作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。柚皮苷无抗人子宫颈癌作用。     

超微粉碎后超临界CO2萃取灵芝孢子挥发油组分的GC-MS分析

采用扫描电子显微镜观察比较原木灵芝孢子超微粉碎后的破壁形态,应用超临界CO2流体萃取技术从破壁孢子粉中提取分离孢子挥发油。气相色谱-质谱联用分析其组分,结果表明超微粉碎后超临界萃取得到的灵芝孢子挥发油化学成分较为丰富。分离得到29个峰,共鉴定出4类25种成分,脂肪类17种,萜类3种,芳香类2种,杂环类3种;有些成分如α-愈创烯(倍半萜)、τ-杜松烯(单萜)等均首次发现于灵芝孢子;此外,1,3,5-环庚三烯(、1α,2β,4α,5β)-四氢-3-氧杂三环辛烷及2-氯-乙基岩芹酸酯等稀有脂肪类化合物也是首次从灵芝孢子中检出。     

紫外分光光度法测定破壁灵芝孢子粉提取物总三萜含量

确定一种破壁灵芝孢子粉提取物总三萜紫外分光光度测定方法。采用紫外分光光度法,以熊果酸为对照品测定样品。溶液在波长548 nm处具有最大吸光度,熊果酸含量在14~54μg范围内呈良好的线性关系,r为0.999 4,平均回收率为92.94%。提示使用上述方法绘制标准曲线可计算出样品中三萜类化合物的含量。测定方法操作简便、检验快速、稳定性高、重复性好,可以用于灵芝孢子粉产品的质量控制。     

破壁灵芝孢子粉的质量探讨

研究和探讨破壁灵芝孢子粉的质量标准,利用性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别和主要成分含量测定的方法,初步掌握破壁孢子粉质量特性。薄层色谱鉴别可见清晰荧光斑点,其醇溶液加入硫酸后可见棕色环。总灰分测定显示:采自岫岩灵芝孢子粉和山东一等孢子粉灰分较低,山东三等孢子粉灰分含量较高。不同来源的样品总三萜类含量各不相同,高者达2.24%,低者1.26%。综合各项检测结果,初步确定了破壁灵芝孢子粉质量评价指标,方法稳定,可操作性强。     

不同灵芝菌株菌丝体乙醇提取物体外抑瘤活性的比较和机理

以人急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞株作为模型,用MTT法测定生长抑制率,流式细胞Annexin Ⅴ实验和DNA含量法研究抑瘤机制,比较了8个灵芝Ganoderma lucidum菌株发酵菌丝体乙醇提取物的体外抗肿瘤活性和抑瘤机制。筛选结果得到了能产生高抑瘤活性乙醇提取物的灵芝菌株L5。其对HL-60细胞的抑制率为91.4±0.9%(72小时,125μg/mL); 作用48小时后,13.3%的细胞发生早期凋亡,G0/G1期细胞比例比对照组增加15.9%,而S期细胞比例则下降了8.4%,G2/M期细胞数减少7.6%。本研究证明了灵芝菌丝体乙醇提取物能有效抑制HL-60肿瘤细胞的体外生长,抑制率与菌株相关,其抑瘤机制与细胞G0/G1期阻滞和诱导凋亡有关。     

灵芝子实体、菌丝体及孢子粉中多糖成分差异比较研究

为探讨灵芝子实体、菌丝体和孢子粉3种材料中多糖成分的差异,分别运用苯酚硫酸法进行多糖含量测定,运用离子色谱分析其酸水解后单糖组成,并运用HPLC分析各多糖图谱及经α-淀粉酶和β-1,3-葡聚糖酶处理后HPLC图谱的变化,结果发现,灵芝菌丝体中多糖含量最高,达到3.81%,孢子粉多糖含量为1.8%,灵芝子实体中多糖含量最低,仅为0.59%;水解后的单糖组成及摩尔比也有差异,子实体的单糖主要为葡萄糖和半乳糖,菌丝体和孢子粉的单糖主要为葡萄糖;HPLC图谱显示3种多糖出峰位置和分子量也不同,酶解效果表明多糖结构也相差较大。各样品多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的产量的影响上,菌丝体与子实体多糖都表现出了很好的活性,而孢子粉多糖却呈现出较低活性。实验结果表明灵芝子实体、菌丝体和孢子粉3种材料的多糖成分差异大,在医药保健品使用中应区分使用。     

HPLC指纹图谱技术在灵芝组织分离试验中的应用

利用HPLC指纹图谱技术研究从同一灵芝子实体不同部位组织分离获得的菌株三萜化合物的差异。用常规组织分离方法获得不同菌株,在A、B、C、D四种培养基上进行出菇试验,运用HPLC指纹图谱技术获得各子实体三萜提取物HPLC指纹图谱,计算图谱间的相似度,分析三萜指纹的差异。结果表明,从子实体不同部位分离获得的四个菌株在同一培养基相同条件下培养获得的灵芝子实体的三萜指纹图谱相似度均大于0.99;同一部位分离获得的菌株在不同培养基相同培养条件下获得的子实体,其粗三萜HPLC图谱相似度均大于0.96;不同的组织分离部位和不同的培养基对灵芝菌株三萜指纹图谱的影响均不显著。18号菌株在C培养基上培养获得的子实体三萜含量最高,上层菌肉为最优组织分离部位,C培养基为最优培养基。灵芝的三萜组成不受生长环境的影响,而生长环境会对其三萜化合物含量产生一定的影响。本文首次应用HPLC指纹图谱方法对灵芝组织分离获得的菌株的差异性进行了研究。     

HPLC指纹图谱技术在灵芝组织分离试验中的应用

利用 HPLC 指纹图谱技术研究从同一灵芝子实体不同部位组织分离获得的菌株三萜化合物的差异。用常规组织分离方法获得不同菌株,在 A、B、C、D 四种培养基上进行出菇试验,运用HPLC指纹图谱技术获得各子实体三萜提取物 HPLC 指纹图谱,计算图谱间的相似度,分析三萜指纹的差异。结果表明,从子实体不同部位分离获得的四个菌株在同一培养基相同条件下培养获得的灵芝子实体的三萜指纹图谱相似度均大于0.99;同一部位分离获得的菌株在不同培养基相同培养条件下获得的子实体,其粗三萜 HPLC 图谱相似度均大于0.96;不     

Comparison of rapid DNA extraction methods applied to PCR identification of medicinal mushroom Ganoderma spp

Four different DNA extraction methods were used to extract genomic DNA of the medicinal mushroom Lingzhi from its developing stage materials, such as mycelium, dry fruiting body, or sliced and spore powder or sporoderm-broken spore powder. The DNA samples were analyzed using agarose gel electrophoresis, UV spectrophotometer, and PCR amplification. According to the average yields and purity of DNA, high salt concentrations and low pH methods were the best for DNA extraction. The mycelia and sporoderm-broken spore powder yielded higher and purer DNA. The method developed could effectively eliminate the influence of the secondary metabolites to DNA extraction. The DNA samples extracted from the developed method could be successfully used for PCR applications.     

灵芝子实体中两个新的天然三萜类化学成分的分离、纯化和鉴定

本文采用硅胶和MCI柱层析的方法,从灵芝Ganodermalucidum子实体中分离纯化三萜类化合物。从灵芝子实体的氯仿萃取层中,分离纯化到灵芝属中的2个新天然产物,运用现代NMR技术分析确定了它们的结构,分别为methyl7β-hydroxy-3,11,15,23-tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oate(methylganoderateD)(Ⅰ)和methyl12β-acetoxy-3,7,11,15-tetraoxo-5α-lanost-8-en-24-oate(methyllucidenateD)(Ⅱ)。