小鼠α1,2岩藻糖基转移酶基因的克隆及表达

本文报告小鼠GDP岩藻糖:β半乳糖苷α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fucosyltansferase,α1,2- FT)基因的克隆,并进行功能鉴定。利用RT-PCR方法克隆小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因编码区 MFUT-Ⅱ,测序后将其插入表达载体pcDNA3．1的多克隆位点,构建表达载体pcDNA3．1-MFUT-Ⅱ; 采用磷酸钙法将其转染于COS-7细胞进行表达,通过对底物特异性比较研究酶的性质;应用 Northern印迹杂交法研究基因在小鼠组织中的表达情况;应用southern印迹杂交法分析基因存在状态。结果证实MFUT-Ⅱ为小鼠α1,2-岩藻糖基转移酶基因家族的新成员,含有一个完整的开放读码框,可编码347个氨基酸．其估计分子质量为39 kDa,和小鼠H及Secl基因具有序列同源性,分别与人类Se基因(79．0％)、大鼠Rat FTB(89％)基因、兔Rabbit FT-Ⅲ基因(77％)具有较高的序列同源性。用MFUT-Ⅱ基因转染的COS-7细胞具有α1,2-FT活性,MFUT-Ⅱ可在多种组织中产生 3．5kb大小的mRNA转录产物。基因Southern印迹杂交分析结果显示:基因MFUT-Ⅱ仅为一个拷贝。这些结果证明MFUT-Ⅱ为小鼠的Se基因。     

小鼠3种α1,2岩藻糖转移酶基因的比较

利用RT-PCR方法克隆小鼠3种GDP岩藻糖：β-半乳糖苷α1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-fucosyltansferase,α1,2-FT）基因编码区MFUT-Ⅰ、MHJT-Ⅱ、MFUT-Ⅲ,序列分析结果表明MFUT-Ⅰ、MFUT-Ⅱ和MFUT-Ⅲ间具有相当的同源性,且分别与人类H基因（78．4％）、Se基因（79．0％）和Secl基因（74．9％）具有序列同源性。将3种基因编码区分别插入表达载体pcDNA3．1的多克隆位点,并将其分别转染于COS-7细胞,结果显示MFUT-Ⅰ和MFUT-Ⅱ基因转染后的COS-7细胞具有α1,2-FT活性,但在MFUT-Ⅲ基因转染后的COS-7细胞中检测不到这种活性。应用Northern印迹杂交法研究基因在小鼠组织中的表达情况。证实MRJT-Ⅱ可在多种组织中产生3．5kb大小的mRNA转录产物,然而MFUT-Ⅰ和MFUT-Ⅲ分别只在附睾和睾丸中显著表达。Southern印迹杂交分析结果显示：基因MFUT-Ⅱ仅为一个拷贝,而MFUT-Ⅰ和MFUT-Ⅲ可能存在2个拷贝。因此,MHJT-Ⅰ、MFUT-Ⅱ和MFUT-Ⅲ分别为鼠的H基因、Se基因和Sec1基因。     

α1，2-岩藻糖转移酶基因转染对卵巢癌细胞生物学行为的影响

为探讨α1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-fucosyhransferase,α1,2-FT）基因转染对卵巢癌细胞RMG—I生物学特性的影响．利用PCR方法克隆人α1,2-FT基因的编码区HFUT—H,构建表达载体pcDNA3．1-HFUT—H．利用磷酸钙法将其转染入卵巢癌细胞系RMG—I,建立α1,2-FT基因稳定高表达细胞株RMG—I—H。采用RT—PCR及α1,2-FT活性测定检测转染前后细胞系α1,2-FT基因表达及α1,2-FT活性的变化,利用免疫细胞化学方法测定细胞表面Lewis y抗原表达变化,利用MTT法、流式细胞仪细胞增殖周期检测方法测定转染前后细胞系生物学特性的变化。分别以转染前细胞RMG—I和转染空载体细胞RMG—I-C为对照组。结果显示转染后细胞α1,2-FT mRNA表达增高,α1,2-FT活性增加20—30倍。转染后的细胞易复层生长,生长速度加快,细胞克隆边缘呈树突状延伸生长。转染后细胞RMG—I—H软琼脂克隆形成率（35％）明显高于对照组RMG—I（13％）及RMG—I—C（12％）,为对照组的2．6倍。RMG—I—H细胞G1期比例从对照组的74．14％下降到59．46％,G2-M期和S期比例分别从对照组的2．05％和23．95％上升到7.32％和33．27％（P〈0．05）。这些结果充分说明。α1,2-FT及Lewisv抗原具有促进RMG—I细胞增殖,提高RMG—I细胞生存能力,促进肿瘤发生、发展的作用。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

α1,2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)基因组DNA中获得α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fuco-syltransferase,α1,2-fuct)基因,得到大小为906 bp的目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中,得到重组表达载体pET-fuct。将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,25℃,0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,可表达出相对分子质量为33 kD的蛋白,与预期分子量一致,说明α1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌BL21中实现表达,应用HPLC法进行酶活检验,酶活达到了13.21 pmol/(mgPr.h)。     

卵巢激素对小鼠围着床期子宫内膜Le^y寡糖表达的调控

研究表明Le^y寡糖介导了胚胎与子宫内膜之间的识别与粘附,在胚胎植入中起重要作用。其α1,2、α1,3岩藻糖基的合成分别与α1,2岩藻糖基转移酶（FUT1）、α1,3岩藻糖基转移酶（FUT4）的催化作用密切相关,应用Western印迹、免疫组化和半定量RT-PCR方法,观察小鼠妊娠早期、去卵巢后雌孕激素处理的子宫内膜Le^y寡糖抗原以及其合成相关的FUT1、FUT4基因的表达,分析卵巢激素对Le^y寡糖表达的调控,结果显示：妊娠早期,FUT1、FUT4基因的转录水平随孕激素水平上程式而呈下降的趋势,这与Le^y寡糖抗原表达一致。进一步观察发现,去卵巢后经孕激素处理,FUT1、FUT4基因及Le^y寡糖抗原表达均较对照组降低,雌激素处理组表达则明显升高;雌孕激素联合作用介于雌激素组和孕激素组之间,结果表明,孕激素能下调FUT1、FUT4基因的表达。雌激素对其有上调作用,两种激素之间表现为相互拮抗,提示雌孕激素可能通过FUT1、FUT4基因转录水平调控Le^y寡糖抗原在小鼠子宫内膜上皮的表达。     

小鼠Oct4基因真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建小鼠Oct4基因真核表达载体并对其表达进行鉴定.方法:以小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)cDNA为模板克隆Oct4基因编码区序列,将其通过定向克隆插入pcDNA3.1(+)栽体多克隆酶切位点(multiple cloning sites,MCS)中,形成pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体.将pcDNA3.1(+)空载体和pcDNA3.1(+)/Oct4重组载体分别转染293T细胞,通过Western Blotting检测Oct4蛋白的表达.结果:成功检测到Oct4蛋白的表达.结论:成功构建了小鼠Oct4基因真核表达载体.     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

小鼠白细胞介素-33基因的克隆及序列分析

目的:克隆小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,并对其进行序列分析。方法:从BALB/c小鼠的脊髓组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1( )载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mIL-33,然后进行酶切鉴定与序列分析。结果:小鼠IL-33基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠IL-33基因的全长编码序列为801 bp,编码266个氨基酸。结论:小鼠IL-33基因成功的克隆并构建了其真核表达载体,为进一步进行IL-33的表达与功能研究奠定了基础。     

长柔毛野豌豆编码甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

甘油－3－磷酸酰基转移酶（GPAT）基因与植物抗冷性密切相关。克隆到的长柔毛野豌豆（Vicia villosa)GPAT基因的编码区完整的cDNA片段长1377bp,编码458个氨基酸残基,与蚕豆（Vicia faba)和豌豆（Pissum sativum)比较,其核苷酸序列的同源性分别为94．1％和93．3％,氨基酸序列的同源性分别为96．9％和98．0％。     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

Expression of an isoform of the testis-specific estrogen sulfotransferase in the murine placenta during the late gestational period

Cytosolic sulfotransferases play essential roles in regulating the activities and transfer of steroids. To evaluate their biological significance in the murine uterus and placenta during the course of gestation, we determined their activities with several steroids as substrates. Activated estrogen sulfotransferase (EST) was found in the placenta and uterus during the late gestational period. Reverse-transcribed cDNA of murine placental EST (mpEST) was isolated from mouse placenta at 18 days of gestation and its expression in the tissue coincided with a change in its enzyme activity. The open-reading frame of mpEST encodes a protein composed of 296 amino acids with a predicted molecular mass of 35.5 kDa and was revealed to be an isoform of the murine testis-specific EST gene (99.7%). Also, the amino acid sequence of mpEST showed 49.6 and 77.9% homology with human placental and endometrial EST, respectively, showing that it corresponds to human endometrial EST. COS-7 cells transfected with mpEST exhibited sulfotransferase activity with the phenolic hydroxy groups of steroids and artificial substrates. The best acceptor substrate was estrogen.     

丙型肝炎病毒NS5A蛋白对Huh7细胞周期的影响

应用PCR技术从含有丙型肝炎病毒（HCV）全长开放阅读框的质粒pBRTM／HCV1～3011中获得NS5A全长基因片段,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-）中。通过酶切、PCR及测序鉴定证实,NS5A基因已正确插入到pcDNA3．1（-）中。再利用脂质体介导转染Huh7细胞,30h后收获细胞,经Western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Huh7细胞中已经获得表达。在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Huh7细胞与pcDNA3．1（-）转染的细胞在转染30h后被收集起来,乙醇固定,PI染色后利用流式细胞仪检测细胞周期变化。G0／G1期由60．6％下降到49．7％,S期由23．9％上升到32．7％,而转染pcDNA3．1（-）细胞的细胞周期与正常的Huh7细胞则差别不大。从而证明HCV NS5A蛋白对Huh7细胞周期具有调节作用。     

Transfection of the c-erbB2/neu gene upregulates the expression of sialyl Lewis X, alpha1,3-fucosyltransferase VII, and metastatic potential in a human hepatocarcinoma cell line.

The pCMV4 plasmid containing the cancer-promoting gene, c-erbB2/neu, was cotransfected into the human hepatocarcinoma cell line 7721 with the pcDNA3 vector, which contains the 'neo' selectable marker. Several clones showing stable expression of c-erbB2/neu were established and characterized by determination of c-erbB2/neu mRNA and its encoded protein p185. Expression of Lewis antigens and alpha1,3-fucosyltransferases and the biological behavior of 7721 cells after c-erbB2/neu transfection were studied using mock cells transfected with the vectors pCMV4 and pcDNA3 as controls. SLe(x) expression on the surface of mock cells was high, whereas expression of SDLe(x), Lex and SLe(a) was absent or negligible. This is compatible with the abundant expression of alpha1,3-fucosyltransferase VII, very low expression of alphafucosyltransferase III/VI, and almost absent expression of alpha1,3-fucosyltransferase IV in the mock cells. After transfection of c-erbB2/neu, expression of SLe(x) and alpha1,3-fucosyltransferase VII were simultaneously elevated, but that of alphafucosyltransferase III/VI was not altered. The expression of both SLe(x) and alpha1,3-fucosyltransferase VII correlated positively with the expression of c-erbB2/neu in different clones, being highest in clone 13, medium in clone 6, and lowest in clone 7. In addition, the adhesion of 7721 cells to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) or P-selectin, as well as cell migration and invasion, were increased in c-erbB2/neu-transfected cells. These increases also correlated positively with the expression intensities of c-erbB2/neu, SLe(x) and alpha1,3-fucosyltransferase VII in the different clones, whereas cell adhesion to fibronectin correlated negatively with these variables. mAbs to SLe(x) (KM93) and SDLe(x) (FH6) significantly and slightly, respectively, abolished cell adhesion to HUVECs or P-selectin and cell migration and invasion. mAbs to SDLe(x) and SLe(a) did not suppress cell adhesion to HUVECs nor inhibit cell migration and invasion. Transfection of alpha1,3-fucosyltransferase VII cDNA into 7721 cells showed similar results to transfection of c-erbB2/neu, and the increased adhesion to HUVECs, cell migration, and invasion were also inhibited significantly by KM93 and slightly by FH6. These results indicate that expression of alpha1,3-fucosyltransferase VII and its specific product, SLe(x), and their capacity for cell adhesion, migration and invasion are closely related. Therefore, the c-erbB2/neu gene is proposed to be a metastasis-promoting gene, and its effects are at least partially mediated by the increased expression of alpha1,3-fucosyltransferase VII and SLe(x).     

HPV6L1/CtMOMP多表位融合基因在COS-7细胞的表达及其在小鼠的免疫效果观察

研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6b结构蛋白L1(HPV6b L1)基因佐剂增强沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP)多表位(Ct MOMP168)DNA疫苗的免疫效果的可能性.构建pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168融合重组质粒,转染COS-7细胞,用RT-PCR、激光共聚焦显微技术及Western印迹技术检测其表达.分别用pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168、pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168及pcDNA3.1(+)质粒肌肉免疫BALB/c小鼠,ELISA检测外周血中IgG及阴道分泌物中sIgA.结果表明,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CtMOMP168可在COS-7细胞中表达;Ct MOMP168组和HPV6b L1/Ct MOMP168组均可刺激小鼠产生抗Ct MOMP特异性的抗体,抗体滴度随免疫次数增加而升高,且HPV6b L1/Ct MOMP168组小鼠产生的抗体滴度明显高于Ct MOMP168组(P0.05).结果提示,分子佐剂HPV6b L1与CtMOMP多表位基因融合能够显著增强Ct MOMP多表位DNA疫苗的体液免疫应答.     

CD真核表达载C 体的构建及在 2KHE39 细胞中的表达

目的：构建含自杀基因胞嘧啶脱氨酶（CD）的真核表达载体pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z—CD,并进行哺乳动物细胞HEK293转染研究。方法：以本实验室保存的含CD基因全长的质粒为模版,用PcR方法扩增CD基因阅读框序列,并定向克隆到带有HAtag的pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z载体上,使目的基因与HAtag在同一阅读框。重组体质粒经EcoRI和BamHI双酶切鉴定,并对插入的CD基因片段进行测序,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z—CD用脂质体介导转染HEK293,提取细胞蛋白,western blot检测CD基因的表达情况.结果：阳性重组质粒pcDNA3．1／HA—myc-His（-）ZCD经Eco砌和BanHI双酶切后,获得约为5．5kb片段和1．3kb插入片段,序列分析表明插入的片段与GenBank发布的序列一致．western blot检测到CD基因的表达。结论：成功构建了含自杀基因CD的真核表达质粒。     

人骨髓基质细胞中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶DcDNA的克隆

为探讨人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)cDNA的结构及功能 ,应用RT PCR从人骨髓基质细胞中克隆了长约 2 6kb的GPI PLDcDNA ,包含完整阅读框架 ,编码 2 3个氨基酸的信号肽及 817个氨基酸的成熟肽 .该cDNA与人胰腺GPI PLDcDNA几乎百分之百同源 ,与人肝脏GPI PLDcDNA同源性为 95 %,氨基酸同源性为 94 %,3者对应的结构基因只有 1个 ,位于人类第 6号染色体上 ,基因组序列长约 80kb ,包括 2 5个外显子 .构建克隆的GPI PLDcDNA的真核表达载体 ,通过脂质体转染能表达GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP)而无GPI PLD活性的G9细胞 ,同时设立对照组检测GPI PLDcDNA的功能 .结果显示 ,对照组细胞几乎检测不到GPI PLD活性 ,其表达的PLAP主要位于细胞膜上 ;而转染GPI PLDcDNA的G9细胞能检测到较高水平的GPI PLD活性 ,而且大部分酶活性存在于培养液中 ,其表达的PLAP也主要被释放入培养液 .结果证实 ,从人骨髓基质细胞中克隆的GPI PLDcDNA有生物学功能 ,它能释放细胞膜上GPI锚定蛋白质 .