番茄B3超家族成员鉴定及生物信息学分析

B3超家族是一类含有B3功能域(与DNA结合的高度保守结构域)的转录因子,在植物生长发育过程中起重要作用。本研究采用生物信息学的方法,利用Pfam中的B3保守结构域序列检索番茄(Solanum lycopersicum L.)蛋白序列,确定了97个B3超家族基因。对番茄B3超家族成员进行了系统进化树分析、染色体定位、结构域分析、组织表达和诱导表达分析等。番茄B3超家族分为LAV、ARF、RAV和REM 4个亚家族,每个亚家族中的数量分别为4、22、9和62个,且在进化树中形成明显不同的分支,每个亚家族都进行了系统进化和结构域分析;番茄12条染色体都含有B3超家族基因;11个成员的表达模式表明,B3超家族同一亚家族成员也具有不同的时空表达模式;在干旱、盐和高温胁迫处理下,部分成员响应强烈并且响应不同的外界信号;而对于ABA处理响应非常弱。本研究将为B3基因超家族成员的生物学功能研究提供参考。     

家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重组表达

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因并建立原核表达体系,检测其表达产物的活性,了解家蝇内源性BG酶特点,为进一步解释家蝇极强环境适应能力和发现新的种群控制措施提供分子生物学基础。以草地贪夜蛾等结构信息相对完整且研究较为透彻的6种代表性昆虫的BG酶基因序列为参照对象,利用同源克隆结合RACE-PCR的方法,从家蝇cDNA中克隆得到BG酶基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。分别采用原核表达载体pET-28a(+)构建原核表达体系并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达BG酶基因的融合蛋白。采用七叶苷平板显色法和DNS法检测表达体系融合蛋白的酶活性,并对其性质进行初步的分析。家蝇体内克隆得到了长度为1933 bp的家蝇BG酶基因全长cDNA序列,推导其为562个氨基酸残基组成的蛋白多肽。重组原核质粒经诱导表达后,在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,证实重组质粒成功表达。重组表达的家蝇BG酶兼具内切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和BG的酶活性。家蝇BG酶是一种新的多功能纤维素酶,是昆虫纤维素酶研究的重要补充。     

硅对辣椒CaWRKY41基因温度胁迫下表达分析

WRKY转录因子是植物界中存在的一类较大的基因家族,参与植物在生物和非生物逆境胁迫中的多种应答。为了研究在低温和高温等非生物胁迫对辣椒CaWRKY41基因表达的影响,以豫椒101为实验材料,在对辣椒CaWRKY41基因克隆的基础上,利用生物软件对其编码蛋白进行分析和构建进化树。结果表明,同源扩增获得的序列含有一个990 bp完整ORF框;对其编码蛋白分析发现,只含有一个WRKY结构域,属于WRKY41家族。亚细胞定位在细胞核中,分子进化树表明与茄属亲缘关系最近,相似性达到92%。荧光定量分析表明,与对照相比,低温、高温胁迫都能诱导CaWRKY41基因表达,表明CaWRKY41基因在应对低温和高温胁迫方面具有重要作用。     

变铅青链霉菌广谱胁迫蛋白对氧化压力响应的研究

【目的】广谱胁迫蛋白(USP)是一种古老的蛋白家族,在链霉菌属细菌中其功能研究尚未报道。以变铅青链霉菌USP蛋白为对象对其功能进行解析。【方法】使用序列比对的方法分析同源性及保守结构域。纯化USP蛋白,用圆二色谱分析蛋白与环腺苷酸(cAMP)的结合对usp(SLI_7517)进行基因中断。检测野生型和usp基因缺失株对偶氮二甲酰胺造成的氧化压力的耐受能力。使用qPCR荧光定量分析技术,检测野生型菌株与usp缺失株在氧化环境中谷胱甘肽过氧化物酶及巯基过氧化物酶基因转录量的差异。【结果】同源序列分析表明链霉菌属来源的USP蛋白序列相互之间相似性较高,USP-like结构域高度保守。USP蛋白在体外结合cAMP引起CD谱的变化。usp基因缺失株对偶氮二甲酰胺更耐受,同时菌株中谷胱甘肽过氧化物酶基因转录量上升。【结论】变铅青链霉菌中USP蛋白能够结合cAMP。usp参与菌体应对氧化环境的调控,对谷胱甘肽过氧化物酶基因的转录有阻遏作用。     

家蝇转铁蛋白基因的克隆和生物信息学分析

为了研究家蝇转铁蛋白基因功能,获得全长cDNA序列并对其蛋白序列进行生物信息学分析,利用在线分析程序和相关工具软件分析转铁蛋白基因的开放读码框,分析编码蛋白的理化性质、结构域、并预测其空间结构和功能。结果表明家蝇转铁蛋白基因编码蛋白由622个氨基酸组成,分子量为70.58kDa,理论等电点为5.33,为稳定蛋白,有跨膜区,含有信号肽,该蛋白属于TR-FER保守结构域家族,亚细胞定位于细胞核,二级结构以无规则卷曲为主,功能预测该蛋白具有酶活性。     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

谷子弯孢菌海藻糖酶基因(ClTRE)及其启动子的克隆和序列分析

海藻糖代谢调控真菌生长、发育及致病性,为了进一步研究海藻糖代谢在谷子弯孢病菌中的功能,对海藻糖酶基因及其启动子进行了克隆.根据植物病原真菌海藻糖酶基因的保守序列设计简并引物,扩增得到海藻糖酶基因同源序列.通过RACE技术,首次在谷子弯孢病菌中克隆得到了海藻糖酶基因(ClTRE)全长cDNA序列.序列分析表明,该基因最大开放阅读框为2037 bp,编码679个氨基酸;二级结构预测表明,该蛋白含约40.48％的α螺旋,12.99％的延伸串,6.5％的β转角,40.03％的不规则卷曲;蛋白保守结构域分析发现其含有海藻糖酶特有的保守位点,与其他植物病原真菌中海藻糖酶基因有51％-86％同源性;利用SignalP3.0软件预测谷子弯孢海藻糖酶蛋白具有信号肽.通过染色体步移技术克隆得到其上游启动子序列,利用TFSEARCH软件分析含有多个与逆境胁迫相关的顺式作用元件,初步推测该基因与逆境胁迫相关.谷子弯孢病菌ClTRE基因及其启动子的克隆,为进一步研究该基因在病菌致病中作用以及以该基因为靶位点的化学防控奠定基础.     

家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

对家蝇变应原原肌球蛋白(Tropomyosin)基因进行同源克隆,序列分析;构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板,进行PCR扩增,获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒,转化到大肠杆菌OrigamiB(DE3)中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp,编码275个氨基酸,理论分子量31.6 kD;等电点为4.65,具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。     

发状念珠藻醛酮还原酶基因NfAKR的克隆与表达

以发状念珠藻细胞为试材,采用PCR技术克隆了醛酮还原酶基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为NfAKR。对基因序列特征进行了生物信息学分析,根据其编码氨基酸序列预测了NfAKR蛋白的三维结构,同时探讨了PEG-6000胁迫下NfAKR的表达特性。结果表明:NfAKR基因的编码序列长912bp,编码304个氨基酸,预测其编码蛋白的相对分子量为33.51kD,理论等电点为4.94,具有醛酮还原酶超家族保守结构域。NfAKR蛋白主要由10个α-螺旋和11β-折叠组成,中间形成一个疏水穴,作为酶的催化活性中心。NfAKR与点形念珠藻处在同一进化枝上,具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析显示,PEG-6000胁迫下NfAKR基因上调表达,当PEG-6000浓度为8%时,其相对表达量为5.66并达到峰值。依据NfAKR基因响应干旱胁迫上调表达的特性,推测醛酮还原酶可能参与发状念珠藻抵御干旱胁迫过程。     

香菇锰过氧化物酶基因（LeMnP1）生物信息学分析及高温胁迫下的表达

本研究对香菇锰过氧化物酶基因（manganese peroxidase 1,MnP1）进行了生物信息学分析,选用香菇出发菌株18和诱变菌株18N44作为实验材料,经测定高温胁迫后菌丝恢复生长速度,分析了高温胁迫过程中香菇锰过氧化物酶基因（LeMnP1）的表达水平及酶活性。结果表明：LeMnP1定位于细胞外,该蛋白属于过氧化物酶超家族,与其他担子菌具有较高的同源性。18N44在高温胁迫后其恢复能力明显强于18;在高温胁迫过程中,18N44中LeMnP1的基因表达水平均高于18,呈现先上升后下降的趋势;在未处理时,18N44的MnP活性显著高于18,随着高温胁迫时间延长,其酶活性显著下降,18的LeMnP1基因表达量及酶活性在整个高温胁迫过程中基本维持稳定。据此推测锰过氧化物酶基因的相对高表达,可能是18N44高温胁迫后恢复生长快的原因之一。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.