冬虫夏草MYB家族基因鉴定及其在生长发育中的表达分析

MYB蛋白是一类广泛存在于真核生物中的转录因子,在真菌的生长发育中发挥调控作用。本研究对冬虫夏草菌中的潜在MYB转录因子家族基因进行了全基因组鉴定和生物信息学分析,并研究了MYB家族成员在冬虫夏草生长发育不同阶段和不同部位的表达模式。结果表明,冬虫夏草MYB转录因子家族包含3个1R-MYB和3个2R-MYB;6个MYB转录因子蛋白均包含近50个保守氨基酸序列,形成螺旋-转角-螺旋的结构。通过分析MYB转录因子基因在不同发育阶段（MYB-1-6）和子实体不同部位（MYB-1、3、6）的相对表达量,发现MYB-1在冬虫夏草整个发育阶段表达较为稳定,MYB-3在子实体成熟阶段（MF）表达量最高,远高于其他阶段,且在MF的顶部可育部分MF-3高表达,表明其可能参与冬虫夏草子实体的有性发育;MYB-6在子座发育初期（YF）的中部YF-2表达量最高,为菌丝阶段（HY）的5倍,表明MYB-6可能参与子座柄部的伸长。     

金针菇信息素信号通路基因在子实体发育过程中的差异表达

【背景】子实体是食用菌的主要商品部位,也是真菌生殖生长的重要结构,其发育受到多种信号途径的调控。【目的】以金针菇(Flammulina filiformis)为材料,对转录组和基因组数据的信息素信号通路基因进行分析获得差异表达的基因,并对其在菌丝生长和子实体发育过程中的表达情况进行分析,以期为研究食用菌子实体发育提供参考。【方法】基于已有的金针菇基因组数据,注释了金针菇信息素信号通路。进一步通过转录组测序鉴定了该通路中参与金针菇子实体发育的关键基因,并对关键基因进行荧光定量PCR验证。【结果】cdc24和ste12基因在子实体发育不同时期的5个样品(原基、伸长期菌柄、伸长期菌盖、成熟期菌柄和成熟期菌盖)中的表达具有显著差异,使用荧光定量PCR技术进行验证与上述结果一致。【结论】cdc24和ste12这2个关键基因可能参与了金针菇子实体发育过程中的组织分化调控机制。     

白菜和甘蓝基因组转座子表达及其对基因调控的潜在影响

转座子或转座元件是大多数真核生物基因组的主要组成成分。甘蓝(Brassica oleracea)基因组比白菜(B. rapa)大主要是转座子的扩增差异造成的。然而, 这两个芸薹属近缘物种转座子表达水平以及对基因的调控和功能的影响目前还不清楚。文章对白菜和甘蓝叶、根、茎3个器官的转录组数据进行了初步分析。结果显示, 转座子的表达量很低, 转录组reads中有1%来自转座子的转录本; 转座子的表达存在器官差异, 且不同类别和家族的转座子表达量相差很大, 相同类别和同一家族的转座子在白菜和甘蓝基因组中的表达活性也不相同。进一步鉴定到转录读出的LTR反转座子, 其与下游基因距离小于2 kb的有41个, 小于100 bp的有9个, 这些LTR的转录读出很可能通过正义或反义的转录本激活或干扰下游基因的表达。同时, 具有转录读出的intact LTR比solo LTR具有更强的读出活性。通过深入分析转座子的插入位点发现, 白菜基因组中转座子插入基因内部的频率比甘蓝基因组中的高; 与反转座子相比, DNA转座子更偏向于插入或保留在基因的内含子当中。这些结果为认识转座子对其他蛋白编码基因的影响提供了基础。     

金针菇几丁质合成酶基因家族鉴定及其表达分析

【背景】几丁质是真菌细胞壁的重要成分,由几丁质合成酶（chitin synthase,CS）催化合成。几丁质合成酶编码基因在大型食用真菌金针菇中的数量及表达规律尚不明确。【目的】探究几丁质合成酶基因在金针菇中存在的数量及其在子实体不同发育时期的表达规律,为其在大型真菌子实体生长发育过程中的功能研究提供基础。【方法】基于已有的金针菇菌株L11基因组数据,结合NCBI其他真菌CS序列鉴定金针菇中几丁质合成酶编码基因的数量,并对其进行生物信息学分析。进一步根据金针菇F19转录组数据以及实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术分析金针菇CS基因家族的表达规律。【结果】在金针菇单核体菌株L11的基因组中鉴定到9个几丁质合成酶基因,系统发育分析表明它们在子实体发育过程中的表达模式可分为4类（皮尔森相关系数=0.85）。【结论】金针菇CS基因家族表达模式在金针菇不同生长发育时期均存在差异,可能参与了子实体发育不同时期和组织的形态建成。     

斑马鱼转座子时空表达特性

转座子是基因组中可移动和扩展的元件,能够插入新的位点,影响基因组和基因的结构和功能,是基因组进化的内在驱动。为探讨转座子的时空表达特性,首先通过生物信息学方法鉴定出斑马鱼9个疑似活性转座子,包括DNA转座子Tc1家族(Tc-a、Tc-b、Tc-c、Tc-d、Tc-e)、反转录转座子ERV家族(ERV-1、ERV-2)和LINE家族(L1-323、L1-21),然后采用实时荧光定量PCR法检测上述转座子在斑马鱼早期胚胎发育7个阶段及成鱼各主要脏器的表达活性。结果表明:Tc1家族在0.75、2.00、3.00 h各阶段无转录活性,在6.00、15.00、24.00、48.00 h各阶段各转座子均有较高转录活性;反转录转座子转录活性最早出现于3 h,最晚出现于15 h,且随着发育时间的延长,转录活性显著增强。9种转座子在成鱼心脏、大脑、肌肉、肝脏、睾丸和卵巢均有表达,且大脑和心脏中的表达水平显著高于其他组织,睾丸表达水平最低。分析表明转座子的表达具有时间和组织的特异性,可能参与斑马鱼胚胎和组织器官发育调控,尤其是大脑和心脏发育。这些结果为进一步研究转座子是否具有基因表达调控功能提供重要参考。     

至少6个突变基因型冬虫夏草菌在冬虫夏草子座中表达的动态变化

本研究检测了在冬虫夏草成熟过程中突变基因型冬虫夏草菌在子座中表达的动态变化。根据冬虫夏草菌基因内转录间隔区(ITS)序列中大量散在的点突变,设计了8个单核苷酸多态性(SNP)延伸引物,采用SNP质谱基因分型法测定各个SNP位点的单核苷酸延伸反应,观察冬虫夏草子座中转换突变和颠换突变基因型菌在冬虫夏草成熟过程中表达的动态变化。其中5个SNP延伸引物(067721-211,067721-240,067721-477,067721-531和067721-581)位于rDNA ITS1和ITS2段,用于区分GC和AT偏倚基因型,但不区分2个AT偏倚基因型。另外3个延伸引物(067740-324,067740-328和067740-360)位于rDNA 5.8S段,用于区分2个AT基因型。采用PCR+EcoRⅠ限制性酶切法检验2个GC偏倚基因型冬虫夏草菌在冬虫夏草成熟过程中表达的动态变化。结果表明:冬虫夏草子座rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段的8个SNP位点的质谱图谱显示冬虫夏草子座中存在至少5个冬虫夏草菌转换突变和颠换突变等位基因。它们的表达在冬虫夏草成熟过程中呈现动态变化。067721-211和067721-477位点的AT偏倚型等位基因的峰高明显高于GC偏倚型;随着冬虫夏草的成熟,这2个位点的AT型等位基因峰高大幅度下降。SNP质谱图不仅显示转换突变的等位基因,颠换突变等位基因也有很高的检出率,它们的峰高在一些位点甚至超过GC和AT基因型等位基因;随着冬虫夏草的成熟,颠换突变等位基因的检出率和峰高趋于下降。在区分2个AT偏倚基因型的研究中,AB067744和AB067740 2个基因型的等位基因同时存在于未成熟冬虫夏草子座中。随着冬虫夏草的成熟,AB067744基因型等位基因的峰高明显降低,而AB067740基因型等位基因的峰高明显升高。PCR产物EcoRⅠ酶切试验发现子座中存在2组GC偏倚型菌,具有完全不同的成熟模式。综上,冬虫夏草子座中存在至少6个突变基因型冬虫夏草菌,其表达随着冬虫夏草的成熟呈现动态变化。这些突变基因型菌表达的动态变化对于冬虫夏草子座的萌发和成熟具有重要菌物学意义。     

冬虫夏草菌C2H2基因家族鉴定及其在砷胁迫下表达分析

C2H2型锌指蛋白转录因子家族是真核生物中广泛存在且具有重要生物学功能的锌指蛋白转录因子之一,在真菌生长发育、分生孢子形成、致病性以及胁迫应答等过程中起着重要作用。砷超标是影响冬虫夏草品质的重要因素之一,本研究基于冬虫夏草菌基因组数据库,利用Hmmsearch程序及PFAM、SMART等在线软件,对冬虫夏草菌C2H2型锌指蛋白(OsC2H2)家族成员进行鉴定,并对OsC2H2基因结构、保守结构域、系统进化分析及砷胁迫下基因表达等进行分析。结果显示,全基因组水平共鉴定出的23条含有C2H2保守结构域的Os C2H2基因,其定位在14条scaffold上且不存在串联重复,不同OsC2H2保守结构域数目及排列方式存在差异;系统进化及基因表达分析显示,18条OsC2H2基因在进化上相对保守,5条OsC2H2基因进化上存在差异,且多数OsC2H2基因响应砷胁迫。通过对全基因组水平OsC2H2进行鉴定及相关生物信息学分析,为进一步研究其结构和功能提供相应理论基础,同时为揭示冬虫夏草砷富集提供参考。     

大型真菌光受体及其功能研究进展

真菌通过光受体感受光信号,光除了调控大型真菌生理周期、形态变化和代谢产物产生外,还是大多数大型真菌原基分化和子实体生长的必要条件。本文对近年来大型真菌的光反应和光受体研究进行了概述。大型真菌中光受体研究目前仅限于WC-1同源蛋白,WC-1既有对光信号应答的能力,同时作为转录因子,又能激活下游基因的表达,但是不同物种中可能存在不同的靶基因。wc-1基因敲除造成裂褶菌、蛹虫草子实体发育阻断。光受体及其作用机制的研究将为大型真菌子实体发育机制研究奠定基础。     

β-1,6葡聚糖酶前体编码基因Ss4p对甘蔗黑穗病菌分泌蛋白组的影响

甘蔗(Saccharum spp.)是世界也是中国主要的糖料作物.由甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑穗病是中国甘蔗生产上最主要的病害,每年造成重大损失.分泌蛋白在真菌侵染寄主植物与获取营养及病理过程起重要作用.本实验室在分析甘蔗黑穗病菌基因组与转录组数据时,发现1个与真菌细胞壁降解有关的β-1,6葡聚糖酶前体的基因Ssa4p.为了揭示Ssa4p对甘蔗黑穗病菌致病性和分泌蛋白组的影响,本研究利用CRISPR/Cas9和T-DNA双元载体所构建的甘蔗黑穗菌基因敲除系统,成功获得了Ssa4p基因的失活突变株.ΔSsa4p突变株(Δ35-Ssa4p)与野生型菌株JG36的配合能力降低且致病性减弱.用iTRAQ方法对Δ35-Ssa4p和野生型菌株的分泌蛋白组进行比较分析,共鉴定到蛋白质1430个,其中上调差异表达蛋白质685个,下调差异表达蛋白质745个.GO功能富集分析及KEGG分析表明,差异蛋白主要定位于无膜细胞器和核糖体,其功能包括参与核糖体、氨基糖和核苷酸糖代谢等生物学过程.本研究发现β-1,6葡聚糖前体影响植物病原真菌的分泌蛋白,加深了对真菌致病性调控机制的认识.     

金针菇高表达基因的密码子偏好性及特征分析

为探究金针菇的密码子偏好性,挖掘高表达基因的特征信息,以金针菇基因组及转录组数据为材料,分析金针菇的密码子偏好性及其影响因素,并对发育阶段高表达基因进行功能注释和顺式元件分析。分析表明,金针菇高表达基因表现出较强的密码子偏好性,且其偏好密码子多以胞嘧啶(C)结尾,此外在高表达基因中存在6种氨基酸的最优密码子较为保守。在进化过程中,金针菇高表达基因密码子偏好性受到自然选择压力的影响较大。功能注释分类表明,高表达基因多为核糖体通路相关的基因,与蛋白质翻译和生物合成相关。顺式元件分析表明,高表达基因启动子区域大多存在MeJA响应元件、ABA响应元件、光响应元件及MYB转录因子结合元件。研究结果可为提高金针菇异源表达效率和挖掘强启动子提供理论基础和思路。     

MADS-box转录因子编码基因Vvrin1在草菇不同发育时期的表达分析

草菇是我国土特产出口的主要种类之一,而采后易开伞问题限制了草菇的贮藏及运输。MADS-box转录因子对植物的成熟衰老和真菌的子实体发育起到重要的调控作用。目前尚未见草菇MADS-box转录因子的相关报道。本研究通过生物信息方法及分子生物学的手段对草菇的基因组、转录组数据进行分析,获得了草菇MADS-box转录因子基因Vvrin1。该基因全长1 392bp,含2个内含子,编码419个氨基酸残基。该转录因子含有一个MADS-box结构域,序列与双孢蘑菇Agaricus bisporus、斑玉蕈Hypsizygus marmoreus和灰盖鬼伞Coprinopsis cinerea的MADS-box转录因子相似性分别为71%、67%和61%。通过表达谱数据及荧光定量PCR分析表明Vvrin1基因在草菇子实体伸长期菌柄的表达量出现高峰,具有极显著性差异（P<0.01）,推测该转录因子参与调控草菇菌柄的伸长,菌盖的开伞。这些结果为草菇成熟衰老（特别是开伞）的调控研究提供数据支持。     

海岛棉WRKY转录因子的全基因组鉴定及响应黄萎病菌侵染的表达分析

WRKY蛋白是植物中一类重要的转录因子,其在很多生物过程中都发挥有重要作用。目前,关于海岛棉(Gossypium barbadense L.)WRKY转录因子的研究相对较少。本研究利用生物信息学方法在海岛棉基因组中鉴定出180个WRKY转录因子(GbWRKY)。根据基因结构及系统进化关系,可将GbWRKY基因分为3组(I～III),II组又可细分为5个亚组(IIa～IIe)。GbWRKY基因在染色体上分布不均匀。基因重复事件分析表明,全基因组复制及区段重复事件是GbWRKY基因数量增多的主要原因。表达分析发现,有61个GbWRKY基因在黄萎病菌(Verticillium dahliae)侵染条件下呈现差异表达,表明它们在黄萎病菌胁迫应答过程中发挥作用。本研究结果揭示了海岛棉WRKY转录因子的结构、进化及表达特征,为进一步研究棉花WRKY基因的功能提供了理论指导。     

β-1,6葡聚糖酶前体编码基因Ssa4p对甘蔗黑穗病菌分泌蛋白组的影响

甘蔗(Saccharum spp.)是世界也是中国主要的糖料作物。由甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑穗病是中国甘蔗生产上最主要的病害,每年造成重大损失。分泌蛋白在真菌侵染寄主植物与获取营养及病理过程起重要作用。本实验室在分析甘蔗黑穗病菌基因组与转录组数据时,发现1个与真菌细胞壁降解有关的β-1,6葡聚糖酶前体的基因Ssa4p。为了揭示Ssa4p对甘蔗黑穗病菌致病性和分泌蛋白组的影响,本研究利用CRISPR/Cas9和T-DNA双元载体所构建的甘蔗黑穗菌基因敲除系统,成功获得了Ssa4p基因的失活突变株。ΔSsa4p突变株(Δ35-Ssa4p)与野生型菌株JG36的配合能力降低且致病性减弱。用i TRAQ方法对Δ35-Ssa4p和野生型菌株的分泌蛋白组进行比较分析,共鉴定到蛋白质1 430个,其中上调差异表达蛋白质685个,下调差异表达蛋白质745个。GO功能富集分析及KEGG分析表明,差异蛋白主要定位于无膜细胞器和核糖体,其功能包括参与核糖体、氨基糖和核苷酸糖代谢等生物学过程。本研究发现β-1,6葡聚糖前体影响植物病原真菌的分泌蛋白,加深了对真菌致病性调控机制的认识。     

油棕DGAT2基因启动子克隆及表达的组织特异性研究

以油棕(Elaeis guineensis Jacq.)叶片基因组DNA为模板,克隆获得长度为1035 bp的二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT2)的启动子区序列。序列分析结果表明,DGAT2基因启动子含有大量光反应元件、激素响应元件及部分转录因子结合位点。本研究同时构建了DGAT2基因启动子和GUS基因植物融合表达载体,通过蘸花法侵染拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),并对转基因拟南芥中GUS基因表达的特异性进行了分析。结果显示,GUS基因在拟南芥各组织中均有表达,但没有明显的组织特异性;荧光定量PCR分析结果表明DGAT2在油棕不同器官中的转录水平存在明显差异。     

低能离子束促进小麦copia-反转录转座子的转录与转座

LTR-反转录转座子是真核基因组重要的组成部分,能通过RNA中间体完成在基因组上的转座。小麦种子受低能氮离子束注入后能促进其反转录转座子的转录,经不同剂量的氮离子束注入的种子发芽24h和48h后,其中的copia-反转录转座子的转录都有不同程度的提高,最高可达到对照的40倍。用基于反转录转座子扩增多态性和反转录转座子微卫星扩增多态性2种分子标记技术扩增经低能氮离子注入后的小麦DNA,指纹图谱显示出了一定的多态性,这说明低能氮离子束激活了小麦中反转录转座子的转座活性。转座子转录活性的增强可调节其邻近基因的表达和mRNA的拼接,反转录转座子插入到基因组上新的位点后,使基因组上的基因发生了重排,这种重排可能表现为植物表型的改变。因此,推测反转录转座子的转录活性提高和转座激活是产生低能离子束注入生物效应的重要原因之一。     

整合子系统介导沙门菌耐药性的研究进展

沙门菌（Salmonella spp.）是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病病原菌。人、畜感染沙门菌后会引起伤寒、副伤寒、胃肠炎、败血症和肠外局灶性感染等疾病。抗生素是治疗沙门菌严重感染的有效手段,随着临床和畜牧业中抗生素的大量使用,使得沙门菌的耐药情况日益严重。整合子是普遍存在于细菌中的一种可移动基因元件,可有效捕获外源基因确保其表达,并复合于转座子、质粒等,使多种耐药基因在细菌种内或者种间进行传播。在过去的二十年中,随着新基因盒和复杂整合子的不断出现,导致整合子系统迅速进化。整合子在沙门菌耐药性传播过程中具有非常重要的作用,因此,本文对整合子系统的分子结构、分类、作用机制,以及沙门菌中存在的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子介导的耐药性及现有检测方法的研究进展进行综述,以期为沙门菌耐药性研究提供参考。     

斑马鱼肌肉高表达基因近端非编码元件分析及功能检测

为鉴定鱼类肌肉组织特异性顺式调控元件,通过分析斑马鱼多个组织的转录组数据,筛选出肌肉高表达基因及低表达基因.通过MEME对肌肉高表达基因和低表达基因非编码区序列特征进行分析,在5个肌肉高表达基因的转录起始位点上游发现了序列保守的DNA区域,包含6个排列顺序一致的DNA基序.将其中一段目标片段插入具有Tol2转座子元件的...     

Tol2转座子介导斑马鱼rps26基因附近增强子捕获及注解分析

随着人类等生物大规模基因组测序工作的完成,认识和理解基因组上表达调控元件成为后基因组时代的重要研究任务,增强子捕获技术是一种鉴定基因组上增强子元件及其对基因表达调控机制的有效方法。本研究选择Tol2转座子系统介导制备的稳定增强子捕获品系TK4系(头部和躯干特异性GFP表达),利用Splinkerette PCR(sp-PCR)、原位杂交和比较基因组学等技术手段进行所捕获增强子的解析研究。将TK4系的F1代与野生型斑马鱼杂交,收集受精卵,于6 hpf(Hour post fertilization)、24 hpf、48 hpf、3 dpf(Day post fertilization)、4 dpf、5 dpf六个发育阶段通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白报告基因的表达模式;然后通过sp-PCR方法克隆到Tol2转座子插入位点斑马鱼基因组侧翼序列,经比对分析表明插入位点位于基因组23号染色体27749253位置,在rps26基因的intron1中,且报告基因插入方向与基因方向相反。在插入位点100 kb的基因组范围内有7个基因,分别为arf3a、wnt10b、wnt1、rps26、IKZF4、dnajc22和lmbr1l。通过VISTA程序对不同脊椎动物基因组同源序列比对结果显示,在rps26基因下游有2个潜在保守的非编码序列区CNS1(Conserved non-coding sequence)和CNS2,为可能的增强子元件。胚胎原位杂交表明:rps26基因的两个转录本有母源性表达,rps26-201在合子中的表达早于rps26-001,而TK4系斑马鱼的GFP在早期(6 hpf)不表达,后期rps26与GFP的表达模式既存在相似性,也存在差异性,提示两者可能既接受共同的增强子调控,但也存在不同增强子调控,所获得的2个潜在的增强子(CNS1和CNS2)可能对附近的基因(包括rps26)发挥差异的时空表达调控作用。本研究首次成功获得rps26基因附近2个潜在增强子,为深入研究这两个增强子对基因组附近基因的表达调控机制奠定基础,本研究所采用的结合技术手段也为增强子解析提供参考。     

Mutator超家族转座子研究进展

转座子是一类可以在基因组中不同遗传位点间移动的DNA序列,在其转移过程中有时会伴随自身拷贝数的增加。作为基因组的重要组成部分,转座子可以通过多种方式影响宿主基因及基因组的结构与功能,进而在宿主的演化过程中扮演重要角色。目前依据转座过程中间体类型的不同可以将其分为I类转座子和II类转座子。Mutator超家族转座子是20世纪70年代在玉米(Zea may L.)中发现的一类特殊的转座子,其属于II类转座子,广泛存在于真核生物基因组中,包含遗传特征明晰可分的众多转座子家族。此外,该超家族转座子转座频率高,倾向于插入基因富含区及低拷贝序列区,可快速产生大量新的突变体,目前已被广泛应用于正向及反向遗传学研究。本文结合近年来相关研究结果,围绕Mutator超家族转座子的分类组成、结构特征、转座机制、插入偏好、靶位点重复序列以及玉米自主性MULEs元件展开综述,并对转座子研究面临的问题及未来研究方向进行了探讨,旨在与研究领域内的同行探讨相关研究的可能突破点、未来发展方向及可能产生的重大影响。