纤维素酶高产菌株Trichoderma atroviride HP35-3原生质体制备及转化

旨在优化深绿木霉(Trichoderma atroviride)菌株HP35-3原生质体制备和转化条件,便于对该菌株进行遗传操作以提高其纤维素酶产量。分别对制备深绿木霉原生质体的菌龄、酶解时间、酶组分及比例和转化条件进行优化。结果显示,利用3mg/m L蜗牛酶、3 mg/m L溶菌酶和3 mg/m L裂解酶酶组分酶解菌龄10 h的菌丝2 h,获得的原生质浓度达到3.5×107个/m L以上,原生质体再生率为61%。利用原生质体进行PEG介导转化,当原生质体浓度为1×108个/m L、外源DNA为5μg时,转化率达到35个转化子/μg DNA。建立的高效原生质体制备及转化体系可用于深绿木霉的遗传转化及菌株改造。     

大丽轮枝菌原生质体的制备及再生

为建立大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)原生质体的制备和再生体系,采用单因素分析法分析了大丽轮枝菌摇培时间、裂解酶浓度、酶解时间和温度、渗透压稳定剂的种类和浓度及pH对原生质体释放的影响;从再生培养基、培养基Agar浓度和酶解时间对原生质体的再生条件进行了优化;并对优化条件下获得的原生质体进行了GFP瞬时表达。结果表明,将分生孢子培养18 h收集菌丝体,以1.2 mol/L的KCl作为渗透压稳定剂,在pH 6.0的条件下,加入10 mg/m L的裂解酶,30℃酶解4 h时,获得的原生质体产量最高,达到3.3×10~7个/mL;在Agar浓度为0.5%的TB3再生培养基中进行原生质体再生,再生率最高,可达22.45%;GFP瞬时表达结果表明,优化条件下获得的原生质体可用于遗传转化材料。     

红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统

原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30~40 h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为：0.3 % lysing enzyme、0.1 % cellulase和1 % snailase的酶组合,30℃作用2.5 h;最适渗透压稳定剂是：1mol /L MgSO4。最适合原生质体再生的培养基为含0.6 mol/L蔗糖的CM培养基。原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5 %和36.4 %。在PEG和CaCl2存在下,以潮霉素B为抗生素选择标记,用质粒pBC-Hygro和pNL1共转化菌株M34原生质体,每微克DNA克获得100个稳定转化子。     

竹黄菌原生质体的制备与再生分析

为了提高竹黄菌(Shiraia bambusicola P.Hennings)中原生质体用于遗传转化时的转化效率,研究竹黄菌原生质体制备及再生的最佳条件,建立竹黄菌原生质体的高效遗传转化体系。本研究以竹黄菌为材料,采用正交试验分析方法,对影响竹黄菌原生质体制备及再生的主要因素,不同酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂及菌龄、不同再生培养基等进行了系统的研究。结果表明,以0.6 mol/L Na Cl为稳渗剂,用组合酶(质量分数1%裂解酶和质量分数1.5%崩溃酶按4:6体积比混合)在33℃条件下对菌龄为6 d的菌丝体酶解2 h,原生质体产量最高,达到10.57×10~6个/m L;以0.6 mol/L蔗糖为稳渗剂,用组合酶(质量分数1%裂解酶和质量分数1.5%崩溃酶按4:6体积比混合)在29℃条件下对菌龄为4 d的菌丝体酶解2 h,原生质体再生率最高,为0.293%;最适合竹黄菌原生质体再生的培养基是TB3再生培养基。     

高效甘蔗黑穗病菌原生质体的制备

原生质体质量是丝状真菌遗传转化成功的关键。本研究以甘蔗黑穗病菌为试验材料,对其原生质制备和再生的条件进行研究。结果表明,将甘蔗黑穗病菌单倍体菌株JG36摇床培养24 h,然后加入5 mg/m L溶壁酶、30 mg/m L纤维素酶和30 mg/m L蜗牛酶的混合酶液,28℃160 r/min摇床上酶解3 h。1.2 M/L Mg SO_4作为原生质体制备时的渗透压稳定剂。在此条件下,制备原生质体得率最高达86.86%,原生质体再生率达到63.26%。     

PEG介导的黑附球菌遗传转化体系的建立

以生防真菌黑附球菌原生质体为受体、潮霉素抗性基因（ hph）为筛选标记,应用PEG介导法进行了遗传转化体系的研究。潮霉素敏感性测试结果表明,黑附球菌对潮霉素的耐受浓度为50mg/L。PEG介导的黑附球菌原生质体最佳遗传转化体系为：30℃下用2%裂解酶酶解黑附球菌菌丝2h,过滤收集原生质体,经MTC清洗重悬后将质粒pYF11-hph转化黑附球菌原生质体,在RM培养基中混匀再生;经潮霉素药剂筛选和PCR验证,表明外源基因 hph已转入到黑附球菌中并获得稳定表达。本实验成功地建立了稳定的PEG介导的黑附球菌遗传转化体系,为研究其代谢途径、生防机制及构建工程菌株提供了技术保障。     

磷脂酶D高产菌株的原生质体紫外诱变选育

为了获得磷脂酶D高产菌株,由链霉菌野生菌株LD0501出发研究原生质体的制备和再生条件,建立原生质体紫外诱变筛选方案。采用酶解法制备原生质体,用紫外线对原生质体诱变,TLC检测突变株产磷脂酶D活力。原生质体的适宜条件:种子培养基中甘氨酸质量浓度5 g/L,菌龄72 h,用3 mg/m L的溶菌酶在30℃下酶解75min。通过原生质体诱变筛选,得到1株高产菌株,磷脂酶D水解活力达4.29 U/m L,提高幅度为180.4%。该方法有效改善了链霉菌野生菌株原生质体的制备效果,紫外诱变筛选显著提高了磷脂酶D的活力,高产突变株具有较好的稳定性。     

黄曲霉菌原生质体的制备和再生技术优化

黄曲霉菌的遗传转化是研究黄曲霉菌致病相关功能基因的前提和基础,而原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。本文分别以黄曲霉孢子和菌丝为材料,研究不同条件下黄曲霉原生质体的形成和再生,结果表明,黄曲霉孢子在酶液浓度为纤维素酶∶蜗牛酶∶溶壁酶=1.5%∶1.5%∶1.5%,30℃酶解3 h,原生质体制备率高达97.3%,再生率达89.2%;黄曲霉菌丝在菌龄为42 h,酶液浓度为纤维素酶∶蜗牛酶∶溶壁酶=1.5%∶1.5%∶1.5%,30℃酶解1 h,可获得最高原生质体产量为2.0×10^6个/m L,再生培养基中以1 mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂时,原生质体再生率达5.5%。故本实验条件下,黄曲霉孢子原生质体的形成和再生优于菌丝。     

杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建

【目的】通过分析不同酶解条件对金黄壳囊孢菌[Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.]原生质体释放的影响,建立高效制备原生质体及其遗传转化体系的方法,为开展杨树腐烂病菌的致病分子机制研究奠定基础。【方法】以杨树腐烂病菌菌株CFCC 89981为受体,在细胞壁降解酶作用下产生用于转化所需的原生质体,通过PEG(Polyethylene glycol)介导将g GFP DNA导入杨树腐烂病菌的原生质体中获得转化子。经PCR扩增、Southern blot和荧光观察验证g GFP DNA插入到杨树腐烂病菌基因组中并表达出GFP(Green fluorescent protein)蛋白。【结果】以p H 5.5的1.2 mol/L KCl为稳渗剂,杨树腐烂病菌菌丝经Driselase和Lysing enzymes共同酶解4 h可获得1.2×108个/m L原生质体,再生率可达63.74%±9.73%,FDA(Fluorescein diacetate)溶液染色结果显示98%左右的原生质体具有较高的活力。利用PEG介导的遗传转化方法,转化效率可达76个/μg DNA。PCR检测和Southern blot均可在转化子基因组中检测到GFP基因片段,且荧光检测转化子的菌丝均呈绿色荧光,表明GFP基因在杨树腐烂病菌中表达。此外,GFP转化子在无潮霉素抗性的PDA培养基中多代转接后仍稳定遗传并表达GFP蛋白。【结论】通过筛选酶解条件,获得高质量、高活性的杨树腐烂病菌原生质体,并利用PEG介导的转化方法建立了高效稳定的原生质体遗传转化体系。该体系的建立为杨树腐烂病菌的后续研究奠定了技术基础。     

卷枝毛霉孢子原生质体的制备与再生

为了构建高产γ-亚麻酸的卷枝毛霉稳定遗传转化体系,利用酶解法对卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)EIM-10的孢子进行原生质体制备。研究酶液组成、渗透压稳定剂、酶解温度、酶解时间等对卷枝毛霉孢子原生质体形成和再生的影响,建立了制备卷枝毛霉孢子原生质体的最适条件:1%纤维素酶和2%溶壁酶为酶解体系,0.5mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,酶解温度32℃,酶解时间2.5 h,再生培养基为0.5 mol/L NaCl高渗培养基。用双层平板培养法进行原生质体再生,在此条件下原生质体的形成量为1.2×106个/mL,再生率为70.5%。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.