聚γ-谷氨酸高产菌的选育与培养基优化

利用合成培养基为筛选培养基,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B6-1为出发菌株,经过三轮紫外线诱变和一轮硫酸二乙酯诱变得到了聚γ-谷氨酸高产突变株枯草芽孢杆菌W003,摇瓶液体发酵的聚γ-谷氨酸产量由出发菌株的10.9 g/L提高到20.5 g/L.单因素实验结果表明,该菌产聚γ-谷氨酸的合适碳源为葡萄糖,氮源为硫酸铵.通过正交实验得到了优化的培养基配方,经36h液体发酵,聚γ-谷氨酸产量可达到45.3 g/L.     

产γ-聚谷氨酸枯草芽胞杆菌菌株的高效诱变及发酵条件优化

以产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)枯草芽胞杆菌菌株SY-ND为出发菌株,采用新型常压室温等离子体技术对其进行诱变以期获得高产菌株,在诱变致死率为80%~98%的条件下,通过检测突变菌株发酵产γ-PGA的量,筛选得到一株高产菌株SY-ND-SFX029。通过正交试验优化得出最佳培养基条件为:蛋白胨8.0g·L-1、蔗糖45.0g·L-1、L-谷氨酸钠35.0g·L-1。依照该条件经过48h发酵,菌株SY-ND-SFX029的γ-PGA产量达35.3g·L-1,比出发菌株SY-ND的γ-PGA产量18.9g·L-1提高86.8%。     

谷氨酸棒杆菌一步法发酵糖质原料生产γ-聚谷氨酸

γ-聚谷氨酸在食品、化妆品、生物医药等领域具有广泛的应用,目前主要的生产菌株是谷氨酸依赖型菌株,在生产过程中需要添加谷氨酸作为前体,因而生产γ-聚谷氨酸的成本较高。文中主要研究从糖质原料一步法发酵合成γ-聚谷氨酸的生产工艺。首先,从产γ-聚谷氨酸的菌株枯草芽孢杆菌中克隆γ-聚谷氨酸合成酶的基因簇pgs BCA,在谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032中进行诱导型和组成型表达,结果显示,仅诱导型表达菌株可以积累γ-聚谷氨酸,产量为1.43 g/L。进一步对诱导条件进行优化,确定诱导时间为2 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,γ-聚谷氨酸产量为1.98g/L。在此基础上,在一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中外源表达pgs BCA,对重组菌进行发酵,结果表明,在摇瓶发酵中γ-聚谷氨酸产量达到10.23g/L,在5L发酵罐中产量达到20.08g/L;继而对γ-聚谷氨酸进行分子量测定,结果显示,产自F343重组菌的γ-聚谷氨酸的重均分子量比产自枯草芽孢杆菌的提高34.77%。文中构建了一步法发酵糖质原料生产γ-聚谷氨酸的新途径,同时为开发其潜在应用奠定了基础。     

一株γ-聚谷氨酸合成菌的筛选与鉴定

从土壤中筛选分离获得一株γ-聚谷氨酸合成菌PGS-1,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),在富含谷氨酸和葡萄糖的培养基中可大量合成γ-聚谷氨酸,摇瓶发酵产量达26 g/L,不同于大多文献报道的微生物合成的γ-聚谷氨酸具有较高的分子量,该菌株合成的γ-聚谷氨酸分子量较低(3×105-4×105 kD),分子量分布较窄,可适用于低分子量要求的应用领域,如作为药物的控缓释载体,值得深入开发研究。     

产聚谷氨酸菌株的筛选及菌株发酵液对玉米幼苗抗旱性的作用

聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)作为新型生物保水剂,具有重要的农业应用价值。从纳豆和豆豉样品中分离筛选到2株聚谷氨酸产生菌Y2与P1。经形态、生理生化特征以及16S r RNA序列分析,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。研究分析聚谷氨酸产生菌发酵液对土壤持水性以及干旱胁迫下玉米抗旱能力的影响。结果表明,Y2和P1菌株发酵液对土壤水分蒸发有明显的减缓效果。与对照相比,施加聚谷氨酸发酵液土壤含水率提高近4%。同时增强玉米幼苗的抗旱性,显著提高了玉米幼苗地上部和地下部生物量。菌株P1的发酵液可使玉米幼苗的地上与地下生物量分别提高40.70%与19.59%。Biolog ECO结果显示,添加菌株Y2和P1的聚谷氨酸发酵液未显著影响土壤中常见微生物群落的代谢多样性和均度。本研究的聚谷氨酸发酵液是一种安全的生物保水剂,可扩大应用于田间生态系统,以增强土壤保水性及植被的抗旱能力。     

高产γ-氨基丁酸酵母菌株的亚硝基胍诱变选育

目的:探讨亚硝基胍诱变选育高产γ-氨基丁酸酵母菌株的方法。方法:使用亚硝基胍对酵母菌株进行诱变;采用含溴甲酚绿的YEPD培养基筛选突变菌,采用薄层层析法和比色法鉴定变异菌株发酵液中的γ-氨基丁酸及其含量;对突变菌株连续继代培养4代,测定各代发酵液中γ-氨基丁酸的含量,鉴定诱变菌株的遗传稳定性。结果:亚硝基胍诱变酵母的最佳浓度为1.0g.L-1,最佳诱变时间为15min;获得了5株突变菌株,菌落呈绿色;薄层层析法鉴定突变菌株都能产γ-氨基丁酸;诱变菌发酵液中的γ-氨基丁酸含量各异,但高于对照,且增长幅度很大;对突变菌株后代遗传稳定性进行了鉴定,结果表明突变菌株4遗传性较稳定。结论:采用1.0g.L-1的亚硝基胍溶液处理酵母菌15min,经筛选鉴定,获得了一株遗传稳定的高产γ-氨基丁酸的酵母菌株。     

一种多聚羟基烷酸产生菌的诱变育种

以野生型自养黄杆菌为出发菌株,经亚硝酸、紫外线、60Coγ射线诱变处理选得三株性状优良的突变株（Uγ－、Uγ－17、Uγ－20）。Uγ－1突变株的菌落形态为菊花形,白色。Uγ-17和Uγ－20突变株的菌落形态均为圆凸光滑型,微黄色。40h的摇瓶发酵结果表明,Uγ－1、Uγ－17、Uγ－20突变株的干细胞产量分别为8．1g／1、11．2g／1、10．5g／1,其产物对干细胞的得率系数（y_p/x）分别为0．74、0．75、0．79。与野生型菌株相比,这些突变株的干细胞产量yp/x分别增加     

γ-聚谷氨酸发酵培养基的Plackett-Burman法优化

以一株γ-聚谷氨酸高产菌——地衣芽孢杆菌GIM-P10为试验菌株,采用逐因子实验法确定γ-聚谷氨酸合成考察因素的参考范围,再采用Plackett-Burman设计法进行培养基的优化,10个实验因子中筛选到四个显著影响因子:柠檬酸、谷氨酸、K2HPO4和MgSO4·7H2O。另外,综合评价实验结果,表明γ-聚谷氨酸的产量与多糖含量呈负向关系,与细胞干重呈正向关系。利用Plackett-Burman设计法发酵产γ-聚谷氨酸可高达21.27g/L,为基础培养基的2倍以上。     

不同分子量γ-聚谷氨酸的生物合成

【背景】不同分子量的γ-聚谷氨酸在农业、化妆品和医药领域具有重要的应用价值,开发不同分子量γ-聚谷氨酸的生物合成工艺已成为研究热点。【目的】在γ-聚谷氨酸生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) KH2中实现不同分子量γ-聚谷氨酸的合成。【方法】分别克隆表达不同来源的水解酶,包括B.subtilis来源的γ-聚谷氨酸水解酶PgdS和YwtE,以及地衣芽孢杆菌来源的SGH。研究不同来源水解酶对B. subtilis KH2产γ-聚谷氨酸分子量的影响。通过改变水解酶处理条件获得不同分子量γ-聚谷氨酸的生物合成工艺。【结果】PgdS、YwtE和SGH均可降低γ-聚谷氨酸的分子量,其中PgdS水解效果最好,可以将γ-聚谷氨酸分子量由原来的1 600 kDa降低为180 kDa。通过优化PgdS的添加量与添加时间,在B. subtilis KH2中获得了分子量为210–600 kDa的γ-聚谷氨酸。【结论】利用水解酶处理,可以在B. subtilis KH2中实现不同分子量γ-聚谷氨酸的生物合成。该方法反应条件温和、分子量可控区间宽,具有良好的应用前景。     

食品上的应用

<正>一株高产率的L一天冬氨酸生产菌株,是从能够产生谷氨酸的野生菌株,经过几个阶段,即缺乏柠檬酸合成酶的谷氨酸营养缺陷型、能产生10克/升的天冬氨酸的原养型回复突变株和抗S一(2一氨基乙基)一L一半脱氨酸突变株1一231菌株(具有低的丙酮酸激酶活性和高半眺氨酸     

玉米原料高产γ-聚谷氨酸优良菌株的选育及发酵条件优化

以实验室筛选到的一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B-1为出发菌株,采用紫外诱变技术对出发菌株进行反复诱变,得到一株能够利用玉米原料生产γ-聚谷氨酸的优良高产菌株B-115,摇瓶发酵γ-聚谷氨酸的产量由原菌株的12.5g/L提高到19.5g/L。再以该菌株为研究对象利用响应面法进行碳源、氮源、谷氨酸钠、金属离子等发酵条件的优化实验,经48h摇瓶发酵,γ-聚谷氨酸产量达到40.98g/ L。     

一株非谷氨酸依赖型聚γ-谷氨酸高产菌株的鉴定与诱变育种

从发酵制品中分离到一株不依赖谷氨酸作为发酵底物的高产菌株PGA-N, 通过形态、生理生化试验和遗传学研究, 确定PGA-N为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)。根据该菌株的产生环境, 设计了无L-谷氨酸发酵基础培养基, 并对该培养基进行了碳氮源优化和菌种诱变筛选。PGA-N经过亚硝基胍和紫外线诱变筛选后得一突变株——PGA-N-C10, 其γ-PGA的产量提高到8.82 g/L。实验还考察了搅拌转速与细胞生物量、γ-PGA产量以及γ-PGA分子量之间的关系, 在搅拌速度为400 r/min时, γ-PGA产率可高达11.00 g/L。     

产L-谷氨酸工程菌株的诱变选育及其发酵效率

以高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌GY1为研究对象,采用ARTP进行全局诱变,进一步提高L-谷氨酸的发酵水平。首先,对谷氨酸棒杆菌GY1原生质体的制备及再生条件进行优化,接着,根据致死率选择最佳的ARTP处理时间,然后,采用96微孔板及摇瓶发酵的方式对突变株进行筛选,最后,对获得的优良突变株进行50 L罐发酵验证。结果显示,溶菌酶浓度为10.0 mg/mL,酶解90 min,原生质体形成率和再生率达到最佳。ARTP最佳处理时间为40 s,致死率达到89.6%,经过初筛与摇瓶复筛,获得突变株YAG117,其摇瓶发酵L-谷氨酸含量达16.3 g/L,较出发菌株提高13.9%,且连续传代五代遗传稳定。50 L补料分批发酵条件下,L-谷氨酸产量在36 h最高,达到216.6 g/L,较出发菌株提高12.9%,糖酸转化率达68.87%,比出发菌株提高了10.2%。ARTP处理GY1菌株原生质体,能够有效积累有利突变,提高突变株发酵生产L-谷氨酸的能力,获得的突变株YAG117也显示了较好的工业化应用潜力。     

添加物对枯草芽胞杆菌γ-聚谷氨酸合成代谢的影响

在枯草芽孢杆菌HCUL-B115代谢网络和发酵特性研究的基础上,通过添加适量的氨基酸、有机酸和维生素对聚γ谷氨酸(γPGA)发酵进行合成代谢进行研究。结果发现,大部分添加物对聚γ谷氨酸的积累都有一定的影响,特别是L谷氨酸、L苯丙氨酸、L精氨酸、L天冬氨酸、L缬氨酸、延胡索酸、草酸、丙二酸、烟酸、维生素B6和抗坏血酸等添加物对菌株HCUL-B115合成聚γ谷氨酸有明显促进作用,添加后产率比不添加任何物质提高20%左右。从代谢层面上分析,这些添加物除了促进菌体自身生长之外,同时防止了菌体对各添加物的过量合成,强化了菌株HCUL-B115合成聚γ谷氨酸的代谢途径。     

透明颤菌血红蛋白基因在地衣芽孢杆菌ATCC9945a中的表达及作用

目的:研究透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在产聚γ-谷氨酸(γ- PGA)的地衣芽孢杆菌ATCC9945a中的表达及对其生物量和产量的影响.方法:以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌的穿梭表达载体pUBC19为骨架,构建含有枯草芽孢杆菌的组成型启动子P43和透明颤菌血红蛋白结构基因的穿梭表达载体pUBC19 - PV,并通过电击转化得到重组的产γ-PGA的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis).一氧化碳差光谱验证重组B.licheniformis 中是否表达了有活性的血红蛋白.摇瓶发酵试验研究重组菌株和对照菌株生物量和发酵产物产量的变化.结果表明,重组菌株的生长明显比对照菌株快,但是γ - PGA的产量却比原始菌株低:在正常供氧时,其产量12.8g/L,比亲株产量21.7g/L下降了41%,贫氧环境下产量8.8g/L,比亲株产量12.8g/L降低了31%.结论:vgb 在重组菌株中表达了有活性的的透明颤菌血红蛋白,并可以促进细胞的生长,但聚谷氨酸的产量却有所下降.文章针对聚γ-谷氨酸产量的下降原因进行了讨论,并对下一步的工作提出了建议.     

聚谷氨酸批式生物合成的主要影响因素研究

采用Bacillus subtilisNX-2菌株,在5 L发酵罐批式操作过程中生物合成γ-聚谷氨酸,实验考察了搅拌转速(300~1 000 r/min)及底物质量浓度对生物合成γ-聚谷氨酸产率的影响。结果表明:转速为400 r/min时,γ-聚谷氨酸产率最高,可高达21.78 g/L。在转速400 r/min的条件下,考察了葡萄糖和谷氨酸浓度对聚谷氨酸生物合成的影响,根据葡萄糖初始质量浓度为40 g/L的实验数据建立了动力学方程。并在葡萄糖初始质量浓度为30,40,50,60g/L的范围内,验证所建动力学方程的稳定性和实用性。结果表明,在以上葡萄糖初始质量浓度范围内,所建模型对B.subtilisNX-2批式生物合成γ-聚谷氨酸产率的预测值与实验值能较好的吻合。     

枯草杆菌 SBS液体发酵联产血栓溶解酶和γ-聚谷氨酸

【目的】利用枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis SBS)进行联产血栓溶解酶和γ-聚谷氨酸研究【方法】本研究以实验室自行分离的Bacillus subtilis SBS为出发菌株,进行了液体发酵,通过正交实验研究了碳、氮源对血栓溶解酶和γ-聚谷氨酸联产的影响,并运用多种检测方法对产物进行了鉴定。【结果】在未添加谷氨酸的培养基中合成了γ-聚谷氨酸,表明该菌是非谷氨酸依赖型菌。合成血栓溶解酶的合适碳、氮源分别是可溶性淀粉和大豆蛋白胨,合成γ-聚谷氨酸的合适碳、氮源分别是蔗糖和NH4Cl。【结论】以蔗糖和大豆蛋白胨、NH4Cl分别作为碳源和氮源进行血栓溶解酶和γ-聚谷氨酸的联产。在蔗糖 10 g/L、大豆蛋白胨 20 g/L、NH4Cl 8 g/L时,血栓溶解酶酶活为 265±25 IU/mL,γ-聚谷氨酸产量为1.183±0.015 g/L,均接近了单独合成时的水平。     

透明颤菌血红蛋白在产聚γ-谷氨酸地衣芽胞杆菌WX-02中的表达

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料.通过构建含有α-淀粉酶(amyE)基因两端交换臂的整合载体pDG1730-vgb,将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到聚γ-谷氨酸生产菌株地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02染色体中,获得重组子M2.一氧化碳差光光谱结果验证M2中表达了有活性的血红蛋白,3 L发酵罐分批发酵结果显示M2的生物量比出发菌株WX-02提高了25.5%,γ-PGA产量提高了20%.     

一株产絮凝剂芽孢杆菌的分离及成份分析

从超高压灭菌的哈密瓜汁中筛选出一株具有高絮凝活性的芽孢杆菌。经形态及生理生化指标测试,初步确定该菌株为Bacillussp.B53。对此菌产生的絮凝活性成分纯化后经高效液相色谱、薄层层析分析表明该絮凝活性物质是聚γ谷氨酸,产量达到12.48g/L,该物质仅由谷氨酸组成,在212nm处有最大吸收峰,电泳结果表明Bacillussp.B53所产聚γ谷氨酸是分子量集中在440～669kD之间的多分子量聚集体,该絮凝剂有效地絮凝各种无机和有机的介质,高岭土和Ca(OH)2效果明显。     

一株γ-多聚谷氨酸生产菌的分离筛选与鉴定

从菜园土壤中取样,在含有谷氨酸的筛选培养基上采用梯度稀释涂布、平板划线的方法,以菌落/菌液黏稠度为指示,分离筛选生产γ-多聚谷氨酸的菌株。利用氨基酸分析仪测定提取纯化后的γ-多聚谷氨酸的产量,并通过形态学、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析鉴定该菌株,并对其合成γ-多聚谷氨酸的功能基因进行PCR扩增。结果表明:筛选到1株产γ-多聚谷氨酸的细菌C1,其液体摇瓶发酵产量为18.4 g/L,相对分子质量为1.8×106;该菌株为革兰氏阳性,菌落黏稠、菌体呈杆状、产芽胞、且形成荚膜;主要生理生化特点为能利用葡萄糖和蔗糖发酵,水解淀粉,H2O2酶阳性,产吲哚等;经16S rDNA鉴定与Bacillus amyloliquefaciens ATCC23350同源性为100%,故命名为Bacillus amyloliquefaciens C1,且拥有γ-多聚谷氨酸合成的相关基因pgsA、pgsB和pgsC。