石榴种皮木质素合成相关转录因子基因PgMYB的克隆与表达

为初步探讨石榴(Punica granatum L.)籽粒硬度产生机理及转录因子基因PgMYB在石榴种皮木质素生物合成途径中的作用,测定了不同石榴品种籽粒硬度及种皮总木质素含量并分析两者关系,利用RT-PCR结合RACE技术,克隆了‘红玉石籽’石榴的1个MYB转录因子基因(PgMYB),通过实时荧光定量PCR技术分析了PgMYB的相对表达量。结果表明:(1)石榴籽粒硬度与种皮总木质素含量呈显著正相关关系,相关系数为0.906。(2)PgMYB基因cDNA全长1 088bp,开放阅读框921bp,编码蛋白由306个氨基酸组成,N端具有2个MYB DNA结合结构域,是植物中一个典型的R2R3-MYB转录因子;同源分析显示,该基因编码的氨基酸序列与银合欢的MYB1和拟南芥的MYB4一致性分别高达89%和84%。(3)在不同籽粒硬度石榴品种中PgMYB的表达与籽粒硬度和种皮总木质素含量呈负相关关系。(4)在石榴各个发育时期中,PgMYB表达与种皮总木质素含量同样呈负相关关系。推测该基因可能抑制石榴种皮总木质素的生物合成。     

棉花GhMYB113基因的克隆与表达分析

该研究利用序列拼接并结合RT-PCR技术,从棉花叶片中克隆了1个MYB基因的cDNA序列,命名为GhMYB113。序列分析表明,该基因开放阅读框为738bp,编码246个氨基酸,含有2个MYB结构域,属R2R3-MYB类型转录因子。该基因的基因组序列长1 927bp,由3个外显子和2个内含子构成。氨基酸序列比对发现该蛋白与其他物种的MYB蛋白有较高的一致性。系统进化分析显示,棉花GhMYB113与现代杂交月季亲缘关系最近。qPCR分析发现,该基因在棉花根中优势表达,在干旱、高盐及低温胁迫后表达量均发生变化,推测GhMYB113可能在植物响应干旱、高盐及低温等非生物胁迫过程中起作用。     

糜子抗旱节水相关基因PmMYB的克隆及表达分析

根据在糜子抗旱节水分子基础研究中获得的一个糜子MYB基因的EST序列, 以其序列及水稻MYB18基因的序列为基础设计引物, 扩增得到1 739 bp的全长基因组序列。序列分析表明, 其包含121 bp(347~467 bp)和93 bp(599~691 bp)的两个内含子, 3个外显子; 全长cDNA序列为1 525 bp, 其中3′非翻译区为212 bp, 5′非翻译区为41 bp, 编码区为1 272 bp, 共编码424个氨基酸, C-端存在一个丝氨酸(Ser, S)丰富区。该基因具有两个典型的MYB类转录因子基因的DNA结合区(DNA-binding domain), 分别为13~63、66~114位氨基酸, 属于典型的R2R3-MYB转录因子。对其与水稻、玉米、火炬松、拟南芥、辣椒、陆地棉、大麦及茄子等9种植物的MYB基因的R2、R3重复区的氨基酸序列多重比较, 表明R2R3重复序列在植物中具有较高的保守性; 基于氨基酸序列的编码区系统进化树分析表明, 不同植物的MYB基因遗传分化很大, 序列相似性为32%~84%, 其中糜子MYB基因与水稻的MYB18相似程度最高(84%), 与大麦和玉米的相似性分别为46%和41%。通过半定量RT-PCR对其表达模式分析表明, 该基因在水分胁迫和干旱后复水条件下上调表达, 与糜子抗旱节水紧密相关。该基因的克隆为进一步探讨利用该基因改良其他植物的抗旱节水性奠定了良好的基础。     

丹参转录因子SmMYB52的基因克隆、表达分析和亚细胞定位

MYB转录因子家族是植物界最大的转录因子家族之一,在植物生长发育、响应生物、非生物胁迫方面发挥重要作用.本研究分别从gDNA和cDNA水平上克隆得到丹参R2R3-MYB转录因子亚家族第24亚组的基因SmMYB52的全长序列,该基因序列全长1 041 bp,包含2个内含子序列和879 bp完整的CDS(Gen-Bank登录号:KF059406),编码292个氨基酸.运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析以及生物信息学分析发现,SmMYB52与拟南芥MYB转录因子AtMYB93亲缘关系最近.利用RT-qPCR测定SmMYB52基因在各器官中的表达,结果显示该基因在根、茎、叶和花中均有表达,根中表达量最高,茎中最低.构建融合表达载体分析SmMYB52蛋白的亚细胞定位,结果显示SmMYB52在细胞核和细胞膜中均有分布.本实验为进一步研究SmMYB52在丹参中的生物学作用提供了科学依据.     

丹参转录因子SmMYB52的基因克隆、表达分析和亚细胞定位

MYB转录因子家族是植物界最大的转录因子家族之一,在植物生长发育、响应生物、非生物胁迫方面发挥重要作用.本研究分别从gDNA和cDNA水平上克隆得到丹参R2R3-MYB转录因子亚家族第24亚组的基因SmMYB52的全长序列,该基因序列全长1 041 bp,包含2个内含子序列和879 bp完整的CDS(Gen-Bank登录号:KF059406),编码292个氨基酸.运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析以及生物信息学分析发现,SmMYB52与拟南芥MYB转录因子AtMYB93亲缘关系最近.利用RT-qPCR测定SmMYB52基因在各器官中的表达,结果显示该基因在根、茎、叶和花中均有表达,根中表达量最高,茎中最低.构建融合表达载体分析SmMYB52蛋白的亚细胞定位,结果显示SmMYB52在细胞核和细胞膜中均有分布.本实验为进一步研究SmMYB52在丹参中的生物学作用提供了科学依据.     

苋菜甜菜红素合成相关基因AmMYB1的克隆及表达分析

应用RACE技术,从‘大红’苋菜中克隆到1条MYB基因cDNA全长序列,命名为AmMYB1(登录号为KU557504)。AmMYB1基因开放阅读框为723bp,可编码240个氨基酸。其基因组序列与cDNA比对后显示,AmMYB1基因含有1个内含子。生物信息学分析表明,AmMYB1具有2个连续的MYB结构域,是一个典型的R2R3-MYB;同源分析显示,该基因编码的氨基酸序列与甜菜红素相关BvMYB1的一致性最高,达到54%。亚细胞定位结果显示,AmMYB1蛋白定位于细胞核。实时荧光定量PCR分析表明,AmMYB1基因在‘大红’苋菜叶片红色部位的表达量高于绿色部位;在甜菜红素含量高的叶和茎中表达量明显高于根;在光照条件下表达量高于遮光处理;在红叶品种中的表达量高于绿叶品种。研究结果表明,AmMYB1基因可能是苋菜甜菜红素合成途径中重要的正调控因子。     

蒙古沙冬青AmMYB4-like基因的克隆与表达分析

基于已有研究工作基础,从蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus(Maxim)Cheng.f]中分离到1个编码MYB类转录因子基因,命名为Am MYB4-like。该序列长度为1 145 bp,含有一个由960 bp组成的开放阅读框,编码319个氨基酸,具有R2和R3保守结构域,属于R2R3-MYB转录因子。荧光定量PCR分析结果表明,Am MYB4-like在叶片中参与低温和干旱胁迫应答,在根中主要参与干旱胁迫应答。构建了p PZP212-Am MYB4-like植物表达载体,旨为进一步研究Am MYB4-like的功能奠定基础。     

丹参转录因子SmMYB7的克隆及表达模式分析

分析丹参转录组数据库(SRX021907),得到一条R2R3-MYB基因,blast比对发现该基因为丹参Sm MYB7(KF059361.1)。分别从g DNA和c DNA水平克隆该基因全长,测序结果表明该基因与公布序列一致,分析发现该基因无内含子序列,包含一个长为954 bp的开放读码框(ORF),编码317个氨基酸残基。多重序列比对和系统进化树分析显示Sm MYB7蛋白与拟南芥At MYB73同属R2R3-MYB第22个亚家族。已有丹参基因信息结合BD walking获得1 974 bp的启动子序列,分析结果表明多种顺式作用元件存在于该基因的启动子区。实时荧光定量PCR分析显示,该基因的表达为组成型,在丹参根、茎、叶、花中都表达;随着花的发育,该基因的表达量逐渐增加;此外,Sm MYB7在盐胁迫、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下表达均上调,推测该基因参与调控植物防御和花的发育。     

小麦非生物胁迫相关基因TaAIM的表达分析

MYB转录因子是一个在植物的应激反应中起着核心作用的蛋白质家族.为了进一步研究小麦非生物胁迫诱导转录因子的表达特性,利用同源克隆的方法从小麦中获得了 1个R2R3-MYB转录因子基因TaAIM,采用生物信息学方法对TaAIM的序列进行分析,采用半定量RT-PCR方法研究TaAIM在不同组织以及不同非生物逆境胁迫条件下的表达.序列分析表明,TaAIM的全长cDNA序列为1 509 bp,开放阅读框为960 bp,编码319个氨基酸,蛋白质预测分子量约为35.207 kD,等电点为4.8,预测其蛋白质二级结构包含12个α-螺旋.系统进化树分析表明,TaAIM与二穗短柄草中的1个R2R3-MYB转录因子有较高的相似性.序列多重比对表明,TaAIM与其同源蛋白序列的MYB结构域均高度保守.半定量RT-PCR分析表明,TaAIM在小麦各个组织中均表达,在根和叶中的表达量较为明显;在盐、PEG、ABA和低温处理后均能够诱导TaAIM表达.这些结果表明,TaAIM基因参与了小麦对非生物胁迫的响应,可为进一步研究TaAIM的生物学功能提供理论基础.     

百合转录因子MYB12的克隆与表达分析

以东方百合‘索邦’(Lilium oriental hybrid ‘Sorbonne’)为材料,克隆获得花青素苷生物合成通路中的关键转录因子Lhsor MYB12基因。序列分析结果显示,Lhsor MYB12最大开放阅读框长720 bp,编码239个氨基酸,具有2个典型的DNA结合结构域;该基因包括3个外显子和2个内含子。该基因的氨基酸序列与郁金香(Tulipa fosteriana W. Irving)中的MYB氨基酸序列相似性最高。系统进化分析结果表明,Lhsor MYB12在MYB基因家族中与已报道的控制花青素苷合成的基因形成一簇。进一步采用染色体步移技术,获得了Lhsor MYB12基因起始密码子上游2143 bp的启动子序列,顺式作用元件预测结果显示,该序列中除核心启动子元件(TATA box)外,还包含有MYB蛋白的绑定位点、光反应元件以及参与昼夜节律等反应的相关元件。基因表达分析结果表明,Lhsor MYB12仅在‘索邦’花丝、花柱和花被片中表达;且在花蕾发育过程中表达量逐渐增高,花蕾盛开时表达量最大,但内、外花被的表达起始阶段不同。黑暗处理可导致Lhsor MYB12表达水平降低;光照条件下该基因的表达水平随处理时间的延长表现出先上升后下降再持续上升的趋势。研究结果提示Lhsor MYB12的表达变化规律可能与其启动子中相应的顺式作用元件相关。     

新疆核桃WJ-CAD和ZJ-CAD基因克隆及时空表达表达分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成中最后一步反应酶。本研究采用RT-PCR技术克隆露仁核桃WJ-CAD基因和硬壳完整核桃ZJ-CAD基因,研究CAD基因在硬壳完整和露仁核桃内果皮中发育过程中的表达特性。WJ-CAD基因cDNA序列含有788 bp ORF,编码258个氨基酸,分子量84.57 kD,理论等电点5.05;ZJ-CAD基因cDNA序列含有666 bp ORF,编码332个氨基酸,分子量81.93 kD,理论等电点5.09;对所编码的蛋白预测分析表明均属于FrmA超基因家族;实时荧光定量PCR结果表明,WJ-CAD基因的相对表达量整体呈现下降-上升-下降的趋势,ZJ-CAD基因的相对表达量整体均呈现上升-下降-上升-下降的趋势,2个基因均在花后65 d表达量达到最高峰,其后期表达量均较低,CAD基因在"温138"核桃内果皮中的表达量远低于同期"纸皮"的表达量。推测"温138"核桃露仁现象由于花后65 d后木质素合成量降低,导致缺乏木质素的积累或影响木质素单体的组成,从而造成内果皮发育不完整(露仁),初步证明CAD基因参与调控木质素合成,露仁现象可能由于硬核期缺乏木质素的积累。     

大白菜BrMYB34-3基因的3′-RACE克隆及表达

以大白菜叶片为材料,根据NCBI数据库中Br MYB34-3基因序列的已知信息,利用3-RACE获得了Br MYB34-3基因全长,用RT-PCR方法对Br MYB34-3在不同组织中的表达进行分析.结果显示,该基因全长1 135 bp,编码280个氨基酸.Br MYB34-3具有R2R3-MYB(含有2个MYB结构域的转录因子)典型的R2、R3结构域及基序.其氨基酸序列与大白菜的Br MYB34-1和Br MYB34-2、拟南芥的At MYB34具有较高的一致性.Br MYB34-3在莲座叶、当天开的花中表达水平较高,在花序顶端表达水平较低,在根和花序轴中未检测到表达,这与拟南芥At MYB34的表达模式不同.研究表明,Br MYB34-3是大白菜中的MYB34同源基因,在功能上可能与拟南芥At MYB34基因存在差异.     

秋葵AeMYB1R1转录因子基因克隆及对胁迫的响应北大核心CSCD

MYB转录因子家族广泛参与了植物对干旱、盐渍、冷害等非生物胁迫的应答。为了深入研究秋葵[Abelmoschus esculentus(L.) Moench]中的MYB类转录因子,该研究以‘北海道1号’秋葵为研究对象,采用PCR方法克隆AeMYB1R1基因,并借助生物信息学进行特征分析;采用qRT-PCR荧光定量方法分析其表达模式及其在非生物胁迫下的表达特性。结果表明:(1)成功克隆获得1个秋葵AeMYB1R1基因;该基因包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸;序列对比和系统进化树结果显示,AeMYB1R1在植物进化过程中具有较高的保守性;AeMYB1R1蛋白分子量为37 891.57 Da,等电点为8.75,含有较多的谷氨酸和较少的色氨酸,以及较多潜在的磷酸化位点和糖基化位点。(2)结构分析显示,AeMYB1R1蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲构成,无信号肽和跨膜结构,为疏水性蛋白;同时,氨基酸序列在第104至第156位含有一个保守结构域,表明其属于SHAQKYF类MYB家族转录因子。(3)qRT-PCR结果显示,AeMYB1R1基因在秋葵叶中的表达量最高,其次是根和茎,具有组织表达特性;与高温和低温胁迫相比,在盐胁迫和干旱胁迫中AeMYB1R1表达量更高,说明AeMYB1R1可能是秋葵抗盐和抗旱的关键转录因子。研究结果为AeMYB1R1基因在秋葵生长发育和抗逆机制中的功能研究奠定了理论依据。     

杨树MYB转录因子家族基因应答盐胁迫表达特性分析

MYB转录因子家族是植物中数量最多的转录因子家族之一,在植物次生代谢调节、信号转导和抗逆等生物过程起重要作用。根据MYB转录因子结构域组成差异可分4个亚家族：即1R-MYB（MYB-relaed）、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB。其中,R2R3-MYB亚家族数量最多,可进一步分为22个亚组;利用生物信息学分析杨树MYB转录因子蛋白序列的保守结构域、系统发生、基因组定位、氨基酸组成和理化性质等;参照拟南芥MYB转录因子功能,预测杨树MYB转录因子功能;基于84K杨转录组测序和RT-qPCR分析,从301个杨树MYB转录因子基因中筛选出69个应答盐胁迫基因（P≤0.05）。其中,上调表达基因32个,下调表达基因37个。该研究可为进一步研究杨树MYB家族基因功能提供参考依据。     

玉米转录因子基因ZmMYB308的克隆及表达分析

MYB类转录因子广泛地参与了植物生长发育的许多重要过程,在调控木质素合成途径中也起着重要作用。为探索MYB转录因子在玉米发育中的功能,该研究利用玉米茎秆转录组测序数据,对玉米茎秆发育过程中差异表达的MYB转录因子进行筛选和分析,在此基础上,通过RT-PCR方法克隆获得了ZmMYB308基因。结果表明:(1)共检测到14个差异表达的MYB转录因子,其中10个下调表达,4个上调表达。(2)ZmMYB308基因包含一个747 bp的开放阅读框,可编码248个氨基酸,相对分子质量27.01 kD,等电点为9.17;系统进化树比对表明,玉米ZmMYB308蛋白和谷子SiMYB308蛋白的亲缘关系较近,相似性高达94%。(3)实时荧光定量PCR结果显示,ZmMYB308在玉米不同发育时期和不同组织中的表达差异显著,且ZmMYB308基因的表达随着玉米茎秆发育的推进呈先升高后降低的趋势,在吐丝期表达量达到最高,随后在灌浆期显著下降;不同组织定量分析显示,ZmMYB308基因在木质素含量高的茎秆和根中高表达。研究推测,ZmMYB308基因可能在玉米茎秆发育过程中起着重要作用,该研究结果为进一步探索玉米木质素合成的分子机制奠定了基础。     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

黄龙病菌侵染过程中柑橘CsMYB基因克隆及表达分析

MYB类蛋白是一类与植物防卫反应有关的转录因子家族,本研究利用构建的甜橙健株与感染黄龙病的病株差减（SSH）文库,采用RACE技术克隆了一个MYB类基因的cDNA全长序列,命名为CsMYB（GenBank登录号为HQ841074）。柑橘CsMYB基因的cDNA全长为1 306 bp,生物信息学分析显示,该基因包括一个909 bp的完整开放读码框以及一个典型的26 bp poly-A,编码302个氨基酸,分子量为32.97 kD,等电点为8.5。同时,还有MYB类基因的保守特征区域,即在N端有两个典型的MYB DNA结合域：R2和R3。实时荧光定量PCR分析表明,柑橘CsMYB基因受到黄龙病菌侵染后的不同时期表达量不同,伴随着黄龙病病程的变化呈现不同的表达变化。推测CsMYB基因是一个转录因子,可能参与柑橘对黄龙病菌的防御反应过程。     

茶树CsMYB123转录因子的克隆及表达特性研究

该实验以茶树品种‘紫娟’为试验材料,利用RT-PCR方法,从茶树cDNA中克隆得到一个R2R3-MYB型基因(CsMYB123)。生物信息学分析显示,CsMYB123基因的开放阅读框为915bp,编码304个氨基酸,蛋白分子量约34.07kD,理论等电点为8.69,含有2个保守的MYB结构域,编码1个R2R3-MYB蛋白;CsMYB123蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)MYB转录因子家族第五亚组的AtMYB123亲缘关系最近;CsMYB123属于亲水性蛋白,无N端信号肽,可能定位于细胞核上。荧光定量PCR分析表明,CsMYB123基因在茶树各组织的表达量大小依次为:一芽一叶第二叶第三叶第四叶老茎嫩茎,且在一芽一叶中的表达量是嫩茎的15.68倍;但CsMYB123的表达受IAA、ABA、ETH和GA3的抑制。花青素含量检测显示,茶树‘紫娟’各组织中花青素的含量高低依次为:第二叶一芽一叶第三叶第四叶嫩茎老茎,且第二叶和一芽一叶的含量分别为老茎的15倍和11倍。研究发现,CsMYB123基因在茶树‘紫娟’的新稍中高水平表达,且其表达模式与不同组织中的花青素含量呈较好的正相关关系,推测CsMYB123基因与茶树花青素合成的调控相关。     

TrMYB308基因的克隆及在苦荞毛状根中的功能分析

MYB类转录因子广泛参与调控植物的生长发育过程,对植物次生代谢也具有重要调控作用。前期研究以V型紫斑白三叶为材料,通过RNA-Seq技术,筛选出与类黄酮合成相关的转录因子TrMYB308。在此基础上从V型紫斑白三叶中克隆出TrMYB308基因,该基因的ORF全长为921 bp,编码306个氨基酸。亚细胞定位结果表明,TrMYB308定位于细胞核。多序列比对和系统发育分析表明,TrMYB308属于典型的R2R3-MYB转录因子,且该蛋白与红三叶TaMYB308和苜蓿MtMYB308等蛋白亲缘关系较近。表达特性分析结果表明,Tr MYB308基因在紫斑白三叶各个组织中均有表达,且其表达量受JA的诱导。在苦荞毛状根中异源表达TrMYB308,结果发现转基因根系中的类黄酮代谢途径部分关键酶基因(如FtF3H和FtFLS)的表达量明显增加;转基因根系总黄酮的含量明显高于对照组。基于以上结果,推测TrMYB308可能参与类黄酮次生代谢生物合成调控。本研究为荞麦类黄酮合成分子机制探索及荞麦品质改良提供了理论依据。     

桃PpNST1和PpSND1转录因子基因的克隆与表达分析

为了解NAC类转录因子与桃果实内果皮发育木质化的关系,本文以桃内果皮为试材,采用同源基因克隆法获得了两个NAC类转录因子的全长编码区,分别命名为PpNST1和PpSND1。序列分析表明2个基因编码区全长均为1188bp,可编码396个氨基酸,其预测蛋白均包含1个NAC结构域和2个特征结构域（LP—box和WQ-box）。氨基酸序列系统进化分析显示PpNST1和PpSND1与苹果、葡萄、毛果杨和拟南芥等参与调控次生细胞壁形成和木质化的NST／SND1类转录因子具有较高同源性。荧光实时定量PCR分析表明,PpNST1和PpSND1的表达水平随内果皮的木质化程度加强而不断升高,分别于盛花期后59和52d达到最高表达量,且它们在内果皮中的表达水平远高于中果皮。对PpNST1和PpSND1下游可能的作用靶标进行进一步的表达分析表明,PpNST1和PpSND1可能在内果皮发育木质化过程中扮演重要角色。